Стандартизация процессов включает в себя их оптимизацию и последующую настройку и гармонизацию, обеспечивающую долгосрочную оптимальную производительность – независимо от пользователя. Стандартизация обеспечивает высокое качество результатов, а также их воспроизводимость и сопоставимость.
Целью (классической) ПЦР является получение надежного и воспроизводимого результата. Для некоторых применений выходПЦР-продукттакже актуально. Для этих реакций необходимо позаботиться о том, чтобы образцы не были повреждены и рабочий процесс ПЦР оставался стабильным. В частности, это означает сведение к минимуму попадания примесей, которые могут привести к ложноположительным или ложноотрицательным результатам или даже подавить реакцию ПЦР. Кроме того, условия реакции должны быть максимально идентичными для каждого отдельного образца в серии, а также должны быть применимы к последующим реакциям (одного и того же метода). Это относится как к составу реакций, так и к типу регулирования температуры в циклере. Ошибок пользователя, конечно, следует избегать, насколько это возможно.
Ниже мы продемонстрируем проблемы, с которыми сталкиваются во время подготовки и на протяжении всего проведения ПЦР, а также подходы к решениям, которые существуют в отношении инструментов и расходных материалов, используемых для стандартизации рабочих процессов ПЦР.
Подготовка реакции
Распределение компонентов реакции в ПЦР-сосуды или планшеты соответственно сопряжено с множеством проблем, которые необходимо решить:
Условия реакции
Точная и точная дозировка отдельных компонентов необходима для достижения максимально идентичных условий реакции. Помимо хорошей техники пипетирования, решающее значение имеет выбор правильного инструмента. Мастер-миксы для ПЦР часто содержат вещества, повышающие вязкость или образующие пену. В процессе пипетирования это приводит к существенному смачиванию раствора.наконечники для пипеток, что снижает точность пипетирования. Использование систем прямого дозирования или альтернативных наконечников для пипеток, менее склонных к намоканию, может повысить точность и точность процесса пипетирования.
Загрязнения
В процессе дозирования образуются аэрозоли, которые, если им удастся достичь внутренней части пипетки, потенциально могут загрязнить другой образец на следующем этапе пипетирования. Этого можно избежать, используя наконечники с фильтром или системы прямого вытеснения.
Расходные материалы, такие каксоветыСосуды и планшеты, используемые в процессе ПЦР, не должны содержать веществ, которые могут поставить под угрозу образец или исказить результат. К ним относятся ДНК, ДНКазы, РНКазы и ингибиторы ПЦР, а также компоненты, которые потенциально могут выщелачиваться из материала во время реакции – вещества, известные как вымываемые вещества.
Ошибка пользователя
Чем больше образцов обрабатывается, тем выше риск ошибки. Легко может случиться, что образец будет помещен не в тот сосуд или не в ту лунку. Этот риск можно значительно снизить за счет легко различимой маркировки скважин. Благодаря автоматизации этапов дозирования «человеческий фактор», т. е. ошибки и отклонения, связанные с пользователем, сводится к минимуму, что повышает воспроизводимость, особенно в случае небольших объемов реакции. Для этого на рабочей станции требуются пластины с достаточной размерной стабильностью. Прикрепленные штрих-коды обеспечивают дополнительную машиночитаемость, что упрощает отслеживание образцов на протяжении всего процесса.
Программирование термоциклера
Программирование прибора может занять много времени и привести к ошибкам. Различные функции термоциклера ПЦР работают вместе, чтобы упростить этот этап процесса и, что наиболее важно, сделать его безопасным:
Простота управления и хорошее руководство пользователя являются основой эффективного программирования. Основываясь на этом фундаменте, администрирование пользователей, защищенное паролем, предотвратит изменение собственных программ другими пользователями. Если используются несколько циклеров (одного типа), полезно, чтобы программу можно было передавать напрямую с одного прибора на другой через USB или соединение. Компьютерное программное обеспечение обеспечивает централизованное и безопасное администрирование программ, прав пользователей и документов на компьютере.
ПЦР-прогон
Во время анализа ДНК амплифицируется в реакционном сосуде, где каждый образец должен быть подвергнут идентичным, одинаковым условиям реакции. Для этого процесса важны следующие аспекты:
Контроль температуры
Превосходная точность контроля температуры и однородность блока циклера являются основой равномерного температурного кондиционирования всех образцов. Высокое качество нагревательных и охлаждающих элементов (элементов Пельтье), а также способ их подключения к блоку являются решающими факторами, определяющими риск несоответствия температур, известного как «краевой эффект».
Испарение
Концентрации отдельных компонентов реакции не должны меняться в ходе реакции за счет испарения. В противном случае возможно, что очень малоПЦР-продуктможет быть сгенерирован или не создан вообще. Поэтому крайне важно свести к минимуму испарение, обеспечив надежное уплотнение. В этом случае нагреваемая крышка термоциклера и уплотнение сосуда работают рука об руку. Доступны различные варианты уплотненияПЦР-планшеты (ссылка: Статья о запечатывании), при этом наилучшая герметизация достигается за счет термосваривания. Другие затворы также могут быть подходящими, при условии, что контактное давление крышки циклера можно отрегулировать в соответствии с выбранным уплотнением.
Стандартизация процессов необходима для обеспечения точных и воспроизводимых результатов в долгосрочной перспективе. Это включает в себя регулярное техническое обслуживание оборудования, чтобы оно всегда было в хорошем рабочем состоянии. Все расходные материалы должны быть стабильно высокого качества во всех выпускаемых партиях, и должна быть гарантирована их надежная доступность.
Время публикации: 29 ноября 2022 г.