Введение
Что такое экстракция нуклеиновой кислоты?
В самых простых терминах экстракция нуклеиновой кислоты - это удаление РНК и/или ДНК из образца и всего избытка, который не требуется. Процесс экстракции изолирует нуклеиновые кислоты из образца и дает их в форме концентрированного элюата, свободного от разбавителей и загрязняющих веществ, которые могут повлиять на любые нижестоящие применения.
Применение экстракции нуклеиновой кислоты
Очищенные нуклеиновые кислоты используются во множестве различных применений, начиная с разных различных отраслей. Здравоохранение, возможно, является той областью, где она используется больше всего, с очищенной РНК и ДНК, необходимыми для множества различных целей тестирования.
Применение экстракции нуклеиновых кислот в здравоохранении включает в себя:
- секвенирование следующего поколения (NGS)
- Генотипирование SNP на основе усиления
- генотипирование на основе массива
- Ограничение пищеварение ферментов
- Анализ с использованием модифицирующих ферментов (например, лигирование и клонирование)
Существуют также другие области, за пределами здравоохранения, где используется экстракция нуклеиновых кислот, включая, помимо прочего, тестирование отцовства, криминалистика и геномику.
Краткая история экстракции нуклеиновой кислоты
Экстракция ДНКДатируются долгим путем, с первой известной изоляцией, которая была выполнена швейцарским врачом по имени Фридрих Мишер в 1869 году. Мишер надеялся решить фундаментальные принципы жизни, определяя химический состав клеток. После неудачи с лимфоцитами он смог получить грубый осадок ДНК из лейкоцитов, обнаруженных в гнойке на выброшенных повязках. Он сделал это, добавив кислоту, а затем щелочи в клетку, чтобы покинуть цитоплазму клетки, а затем разработал протокол для отделения ДНК от других белков.
Следуя новаторским исследованиям Мишера, многие другие ученые продолжали продвигаться и разработать методы для изоляции и очистки ДНК. Эдвин Джозеф Кон, протеиновый ученый разработал много методов очистки белка во время Второй мировой войны. Он отвечал за изоляцию фракции сывороточного альбумина плазмы крови, что важно для поддержания осмотического давления в кровеносных сосудах. Это было важно для поддержания живых солдат.
В 1953 году Фрэнсис Крик вместе с Розалиндой Франклин и Джеймсом Уотсоном определил структуру ДНК, показывая, что она состояла из двух цепей длинных цепей нуклеотидов нуклеоиновых кислот. Это прорывное открытие проложило путь для Месельсона и Штала, которые смогли разработать протокол центрифугирования градиента плотности, чтобы изолировать ДНК от бактерий E. coli, поскольку они продемонстрировали полуконсервативную репликацию ДНК во время их эксперимента 1958 года.
Методы экстракции нуклеиновой кислоты
Каковы 4 стадии экстракции ДНК?
Все методы извлечения сводятся к одинаковым фундаментальным шагам.
Нарушение клетокПолем Эта стадия, также известная как лизис клеток, включает в себя разрушение клеточной стенки и/или клеточной мембраны, чтобы выделить внутриклеточные жидкости, содержащие интересующие нуклеиновые кислоты.
Удаление нежелательного мусора. Это включает в себя мембранные липиды, белки и другие нежелательные нуклеиновые кислоты, которые могут мешать нижестоящим применению.
Изоляция. Существует ряд различных способов выделения интересующих нуклеиновых кислот от созданного вы очищенного лизата, которые падают между двумя основными категориями: на основе растворов или твердого состояния (см. Следующий раздел).
Концентрация. После того, как нуклеиновые кислоты были выделены из всех других загрязняющих веществ и разбавителей, они представлены в высококонцентрированном элуате.
Два типа извлечения
Существует два типа экстракции нуклеиновой кислоты - методы, основанные на растворе и методы твердотельного состояния. Метод, основанный на растворе, также известен как метод химической экстракции, поскольку он включает использование химических веществ для разрушения клетки и доступа к нуклеическому материалу. Это может использоваться либо органические соединения, такие как фенол и хлороформ, или менее вредные и, следовательно, более рекомендуемые неорганические соединения, такие как протеиназа К или силика.
Примеры различных методов химической экстракции, чтобы разбить клетку, включают:
- осмотическое разрывание мембраны
- Ферментативное пищеварение клеточной стенки
- Солюбилизация мембраны
- с моющими средствами
- с щелочным лечением
Твердовые методы, также известные как механические методы, включают в себя использование того, как ДНК взаимодействует с твердым субстратом. Выбирая бусин или молекулу, с которой ДНК будет связываться, но аналит не будет, можно разделить их. Примеры методов извлечения твердофазной фазы, включая использование кремнезема и магнитных шариков.
Магнитное извлечение бусин объяснено
Метод экстракции магнитной бусинки
Потенциал для извлечения с использованием магнитных шариков был впервые признан в патенте США, поданном Тревором Хокинсом, в исследовательский институт Уайтхедского института. Этот патент признал, что можно было извлечь генетический материал, связывая его с твердым носителем, который может быть магнитным шариком. Принцип состоит в том, что вы используете высоко функционализированный магнитный шарик, на котором будет связываться генетический материал, который затем может быть отделен от супернатанта, применяя магнитную силу на внешнюю часть сосуда, держащего образец.
Зачем использовать магнитное извлечение шариков?
Технология извлечения магнитных шариков становится все более распространенной из -за потенциала, которую она обладает для быстрой и эффективной процедуры экстракции. В последнее время были разработаны разработки высоко функционализированных магнитных шариков с подходящими буферными системами, которые сделали возможную автоматизацию экстракции нуклеиновых кислот и рабочий процесс, который является очень ресурсным светом и экономически эффективным. Кроме того, методы магнитного извлечения гранул не включают ступени центрифугирования, которые могут вызвать сдвиговые силы, которые разбивают более длинные кусочки ДНК. Это означает, что более длинные нити ДНК остаются нетронутыми, что важно при тестировании геномики.
Время сообщения: 25-25-2022