Введение
Что такое экстракция нуклеиновых кислот?
Проще говоря, экстракция нуклеиновой кислоты — это удаление РНК и/или ДНК из образца и всего ненужного избытка. В процессе экстракции нуклеиновые кислоты выделяются из образца и получаются в виде концентрированного элюата, свободного от разбавителей и примесей, которые могут повлиять на последующие применения.
Применение экстракции нуклеиновых кислот
Очищенные нуклеиновые кислоты используются во множестве различных применений в различных отраслях. Здравоохранение, пожалуй, является той областью, где он используется чаще всего, поскольку очищенная РНК и ДНК необходимы для множества различных целей тестирования.
Применение экстракции нуклеиновых кислот в здравоохранении включает:
- Секвенирование следующего поколения (NGS)
- Генотипирование SNP на основе амплификации
- Генотипирование на основе массивов
- Рестриктивные ферменты пищеварения
- Анализы с использованием модифицирующих ферментов (например, лигирование и клонирование)
Помимо здравоохранения, существуют и другие области, где используется экстракция нуклеиновых кислот, включая, помимо прочего, тестирование на отцовство, судебную экспертизу и геномику.
Краткая история экстракции нуклеиновых кислот
экстракция ДНКвосходит к далекому прошлому: первое известное выделение было проведено швейцарским врачом по имени Фридрих Мишер в 1869 году. Мишер надеялся раскрыть фундаментальные принципы жизни, определяя химический состав клеток. После неудачи с лимфоцитами ему удалось получить грубый осадок ДНК из лейкоцитов, обнаруженных в гное на выброшенных бинтах. Он сделал это, добавив в клетку кислоту, а затем щелочь, чтобы покинуть цитоплазму клетки, а затем разработал протокол отделения ДНК от других белков.
После новаторских исследований Мишера многие другие ученые продолжили развивать и развивать методы выделения и очистки ДНК. Эдвин Джозеф Кон, ученый-протеинолог, разработал множество методов очистки белков во время Второй мировой войны. Он отвечал за выделение из плазмы крови фракции сывороточного альбумина, который важен для поддержания осмотического давления в кровеносных сосудах. Это имело решающее значение для сохранения солдат в живых.
В 1953 году Фрэнсис Крик вместе с Розалиндой Франклин и Джеймсом Уотсоном определил структуру ДНК, показав, что она состоит из двух нитей длинных цепочек нуклеотидов нуклеиновой кислоты. Это революционное открытие проложило путь Мезельсону и Сталю, которые смогли разработать протокол центрифугирования в градиенте плотности для выделения ДНК из бактерий E. Coli, продемонстрировав полуконсервативную репликацию ДНК во время своего эксперимента 1958 года.
Методы экстракции нуклеиновых кислот
Каковы 4 стадии выделения ДНК?
Все методы экстракции сводятся к одним и тем же фундаментальным шагам.
Разрушение клеток. Этот этап, также известный как лизис клеток, включает разрушение клеточной стенки и/или клеточной мембраны с целью высвобождения внутриклеточной жидкости, содержащей интересующие нуклеиновые кислоты.
Удаление нежелательного мусора. Сюда входят мембранные липиды, белки и другие нежелательные нуклеиновые кислоты, которые могут мешать последующим применениям.
Изоляция. Существует несколько различных способов выделения интересующих нуклеиновых кислот из созданного вами очищенного лизата, которые делятся на две основные категории: в растворе или в твердом состоянии (см. следующий раздел).
Концентрация. После того как нуклеиновые кислоты были изолированы от всех других примесей и разбавителей, они представлены в высококонцентрированном элюате.
Два типа добычи
Существует два типа экстракции нуклеиновых кислот – методы на основе растворов и методы в твердом состоянии. Метод на основе раствора также известен как метод химической экстракции, поскольку он включает использование химических веществ для разрушения клетки и доступа к нуклеиновому материалу. Для этого можно использовать либо органические соединения, такие как фенол и хлороформ, либо менее вредные и, следовательно, более рекомендуемые неорганические соединения, такие как протеиназа К или силикагель.
Примеры различных методов химической экстракции для разрушения клетки включают:
- Осмотический разрыв мембраны
- Ферментативное расщепление клеточной стенки.
- Солюбилизация мембраны
- С моющими средствами
- С обработкой щелочью
Твердотельные методы, также известные как механические методы, включают в себя изучение того, как ДНК взаимодействует с твердым субстратом. Выбрав шарик или молекулу, с которой ДНК будет связываться, а аналит - нет, можно разделить их. Примеры методов твердофазной экстракции, включая использование диоксида кремния и магнитных шариков.
Объяснение извлечения магнитных шариков
Метод извлечения магнитных шариков
Потенциал экстракции с использованием магнитных шариков был впервые признан в патенте США, поданном Тревором Хокинсом для исследовательского института Института Уайтхеда. Этот патент подтвердил, что можно извлечь генетический материал, привязав его к твердому носителю, которым может быть магнитный шарик. Принцип заключается в том, что вы используете высокофункциональные магнитные шарики, с которыми связывается генетический материал, который затем можно отделить от надосадочной жидкости, приложив магнитную силу к внешней стороне сосуда, в котором находится образец.
Зачем использовать извлечение магнитных шариков?
Технология экстракции магнитными шариками становится все более распространенной из-за ее потенциала для быстрых и эффективных процедур экстракции. В последнее время были разработаны высокофункциональные магнитные шарики с подходящими буферными системами, которые сделали возможной автоматизацию экстракции нуклеиновых кислот и рабочий процесс, который является очень экономичным и экономичным. Кроме того, методы экстракции магнитными шариками не включают этапы центрифугирования, которые могут вызвать силы сдвига, разрушающие более длинные фрагменты ДНК. Это означает, что более длинные цепи ДНК остаются неповрежденными, что важно при геномном тестировании.
Время публикации: 25 ноября 2022 г.