Хотя теоретически одной молекулы матрицы было бы достаточно, для классической ПЦР обычно используются значительно большие количества ДНК, например, до 1 мкг геномной ДНК млекопитающих и всего лишь 1 пг плазмидной ДНК. Оптимальное количество во многом зависит от количества копий целевой последовательности, а также от ее сложности.
Если используется очень мало шаблона, для получения достаточного количества продукта потребуется соответствующее увеличение количества циклов амплификации. Полимераза Taq, которая используется в большинстве экспериментов ПЦР, не обладает корректирующей функцией (3'-5' экзонуклеазная активность); таким образом, ошибки, возникающие во время амплификации, исправить невозможно. Чем выше количество циклов, тем более распространенным будет увеличение дефектного продукта. Если же количество матрицы слишком велико, то увеличится вероятность отжига праймеров с другими (не стопроцентно комплементарными) последовательностями, а также образования димеров праймеров, что приведет к амплификации побочные продукты. Во многих случаях ДНК выделяют из клеточных культур или микроорганизмов и впоследствии используют в качестве матрицы ПЦР. После очистки необходимо определить концентрацию ДНК, чтобы иметь возможность определить объем, необходимый для установки ПЦР. Хотя электрофорез в агарозном геле может служить для оценки, этот метод далек от точности. УФ-Вид-спектрофотометрия признана золотым стандартом количественного определения нуклеиновых кислот; Этот прямой и, следовательно, простой и быстрый метод измеряет поглощение образца при длине волны 260 нм, а концентрация рассчитывается с помощью коэффициента пересчета.
Однако если концентрация ДНК очень низкая (< 1 мкг/мл дцДНК) или если она загрязнена веществами, которые также поглощают в диапазоне 260 нм (например, РНК, белок, соли), этот метод достигнет своих ограничений. В случае очень низких концентраций показания вскоре станут слишком неточными, чтобы их можно было использовать, а загрязнения приведут к (иногда огромному) завышению фактического значения. В этом случае альтернативой может стать количественная оценка с использованием флуоресценции. Этот метод основан на использовании флуоресцентного красителя, который специфически связывается с дцДНК, только комплекс, включающий нуклеиновую кислоту и краситель, возбуждается светом и впоследствии излучает свет с немного большей длиной волны. Здесь интенсивность флуоресцентного сигнала пропорциональна количеству ДНК, и для определения концентрации ее оценивают по отношению к стандартной кривой. Преимущества этого метода заключаются в специфичности связи, исключающей внешние воздействия, вызванные загрязнением, а также в получаемой в результате способности обнаруживать очень низкие концентрации ДНК. Пригодность любого метода зависит главным образом от концентрации и чистоты образца; во многих случаях может быть даже целесообразно применять оба метода параллельно.
Время публикации: 30 ноября 2022 г.