Несмотря на то, что теоретически, одной молекулы шаблона было бы достаточным, значительно большие количества ДНК обычно используются для классической ПЦР, например, до 1 мкг ДНК геномного млекопитающего и всего лишь 1 пг плазмидной ДНК. Оптимальная сумма в значительной степени зависит от количества копий целевой последовательности, а также от ее сложности.
Если используется очень небольшой шаблон, для получения достаточного количества продукта потребуется соответствующее увеличение количества циклов усиления. Так-полимераза, которая используется для большинства экспериментов с ПЦР, не имеет функции коррекции (3'-5 ′ экзонуклеазной активности); Таким образом, ошибки, возникающие во время амплификации, не могут быть исправлены. Чем выше число циклов, тем более распространенным будет амплификация недостатка продукта. Если, с другой стороны, количество шаблона слишком высока, вероятность отжига праймеров в других (не на сто процентов бесплатных), а также формирование димеров праймеров увеличится, что приведет к усилению побочные продукты. Во многих случаях ДНК выделяется из клеточных культур или из микроорганизмов и впоследствии используется в качестве шаблона ПЦР. После очистки необходимо определить концентрацию ДНК, чтобы иметь возможность определить объем, который необходим для настройки ПЦР. В то время как электрофорез в агарозном геле может служить для оценки, этот метод далеко не точный. Ультрафиолетовая спектрофотометрия была установлена в качестве золотого стандарта для количественной оценки нуклеиновых кислот; Этот прямой и, следовательно, простой и быстрый метод измеряет поглощение образца при 260 нм, а концентрация рассчитывается с помощью коэффициента конверсии.
Если концентрация ДНК очень низкая, однако (<1 мкг/мл дсДНК), или если она загрязнена веществами, которые также поглощают в диапазоне 260 нм (например, РНК, белок, соли), этот метод достигнет его ограничений. В случае очень низких концентраций показания вскоре станут слишком неточными, чтобы быть полезными, и загрязнения приведут к (иногда огромной) переоценке фактического значения. В этом случае количественное определение с использованием флуоресценции может представлять альтернативу. Этот метод основан на использовании флуоресцентного красителя, который специфически связывается с дсДНК, только комплекс, содержащий нуклеиновую кислоту и краситель, возбуждается светом, и впоследствии излучит свет немного более высокой длины волны. Здесь интенсивность флуоресцентного сигнала пропорциональна количеству ДНК, и для определения концентрации она оценивается по сравнению со стандартной кривой. Преимущества этого метода опираются на специфичность связи, которая исключает внешние влияния, введенные в результате загрязнения, а также на полученную способность обнаруживать очень низкие концентрации ДНК. Пригодность любого метода зависит главным образом от концентрации и чистоты образца; Во многих случаях может даже быть рекомендуется применять оба метода параллельно.
Время сообщения: 30-2022 ноября