Pentru reacțiile de amplificare de succes, este necesar ca componentele individuale ale reacției să fie prezente în concentrația corectă în fiecare preparat. În plus, este important să nu existe nicio contaminare.
În special atunci când trebuie să se pregătească multe reacții, s-a stabilit să se pregătească un așa-numit amestec principal în loc să pipeteze fiecare reactiv separat în fiecare vas. Amestecuri preconfigurate sunt disponibile comercial, în care se adaugă doar componente specifice probei (grund) și apă. Alternativ, mixul principal poate fi pregătit singur. În ambele variante, amestecul este distribuit în fiecare vas PCR fără un șablon și proba individuală de ADN este adăugată separat la sfârșit.
Utilizarea unui amestec principal are mai multe avantaje: În primul rând, numărul de etape de pipetare unică este redus. În acest fel, atât riscul erorilor utilizatorului în timpul pipetării, cât și riscul contaminării sunt minimizate și, desigur, se economisește timp. În principiu, precizia de pipetare este de asemenea mai mare, deoarece sunt dozate volume mai mari. Acest lucru este ușor de înțeles la verificarea datelor tehnice ale pipetelor: cu cât volumul dozat este mai mic, cu atât abaterile pot fi mai mari. Faptul că toate preparatele provin din același vas are un efect pozitiv asupra omogenității (dacă sunt bine amestecate). Acest lucru îmbunătățește, de asemenea, reproductibilitatea experimentelor.
La prepararea amestecului principal, trebuie adăugat cel puțin 10 % volum suplimentar (de exemplu, dacă sunt necesare 10 preparate, calculați pe baza a 11), astfel încât chiar și ultimul vas să fie umplut corespunzător. În acest fel, pot fi compensate (ușoare) inexactități de pipetare și efectul pierderii probei la dozarea soluțiilor care conțin detergent. Detergenții sunt conținuți în soluții de enzime, cum ar fi polimerazele și amestecurile principale, provocând formarea de spumă și reziduuri pe suprafața interioară a normalului.vârfuri de pipetă.
În funcție de aplicație și de tipul de lichid care trebuie distribuit, trebuie aleasă tehnica corectă de pipetare (1) și echipamentul adecvat. Pentru soluțiile care conțin detergenți, se recomandă un sistem de deplasare directă sau așa-numitele vârfuri de pipetă „low retention” ca alternativă pentru pipetele cu pernă de aer. Efectul deVârf ACE PIPETTEse bazează pe o suprafață deosebit de hidrofobă. Lichidele care conțin detergenți nu lasă o peliculă reziduală la interior și la exterior, astfel încât pierderea de soluție poate fi minimizată.
Pe lângă dozarea exactă a tuturor componentelor, este de asemenea important ca preparatele să nu fie contaminate. Nu este suficient să folosiți consumabile de înaltă puritate, deoarece procesul de pipetare într-o pipetă cu pernă de aer poate produce aerosoli care rămân în pipetă. ADN-ul care poate fi conținut în aerosol poate fi transferat de la o probă la alta în următoarea etapă de pipetare și astfel duce la contaminare. Sistemele de deplasare directă menționate mai sus pot minimiza și acest risc. Pentru pipetele cu pernă de aer, este logic să folosiți vârfuri de filtru pentru a proteja conul pipetei reținând stropii, aerosolii și biomoleculele.
Ora postării: 06-12-2022