Criovialesunt utilizate în mod obișnuit pentru depozitarea criogenică a liniilor celulare și a altor materiale biologice critice, în dewar umplute cu azot lichid.

Există mai multe etape implicate în conservarea cu succes a celulelor în azot lichid. În timp ce principiul de bază este o înghețare lentă, tehnica exactă folosită depinde de tipul de celulă și de crioprotectorul utilizat. Există mai multe considerente de siguranță și cele mai bune practici de luat în considerare atunci când depozitați celulele la temperaturi atât de scăzute.

Această postare își propune să ofere o privire de ansamblu asupra modului în care criovialele sunt stocate în azot lichid.

Ce sunt Criovialele

Criovialele sunt fiole mici, cu capac, concepute pentru depozitarea probelor lichide la temperaturi extrem de scăzute. Acestea asigură că celulele conservate în crioprotector nu intră în contact direct cu azotul lichid, minimizând riscul fracturilor celulare, beneficiind în același timp de efectul de răcire extrem al azotului lichid.

Fiolele sunt de obicei disponibile într-o gamă largă de volume și modele - pot fi filetate intern sau extern cu funduri plate sau rotunjite. Sunt disponibile și formate sterile și nesterile.

Cine FoloseșteCyrovialspentru a stoca celulele în azot lichid

O serie de NHS și laboratoare private, precum și instituții de cercetare specializate în banca de sânge din cordonul ombilical, biologia celulelor epiteliale, imunologie și biologia celulelor stem folosesc criovialuri pentru a crioconserva celulele.

Celulele conservate în acest mod includ celule B și T, celule CHO, celule stem hematopoietice și celule progenitoare, hibridoame, celule intestinale, macrofage, celule stem mezenchimale și celule progenitoare, monocite, mielom, celule NK și celule stem pluripotente.

Prezentare generală a modului de depozitare a criofialelor în azot lichid

Crioconservarea este un proces care păstrează celulele și alte construcții biologice prin răcirea lor la temperaturi foarte scăzute. Celulele pot fi stocate în azot lichid ani de zile fără pierderea viabilității celulare. Aceasta este o schiță a procedurilor utilizate.

Pregătirea celulelor

Metoda exactă de preparare a probelor va varia în funcție de tipul de celulă, dar, în general, celulele sunt colectate și centrifugate pentru a dezvolta o pelită bogată în celule. Acest pelet este apoi resuspendat în supernatantul amestecat cu crioprotector sau un mediu de crioconservare.

Mediu de crioconservare

Acest mediu este folosit pentru a conserva celulele în mediile cu temperatură scăzută la care vor fi supuse prin inhibarea formării cristalelor intra și extracelulare și, prin urmare, a morții celulare. Rolul lor este de a oferi un mediu sigur și protector pentru celule și țesuturi în timpul proceselor de congelare, depozitare și dezghețare.

Un mediu cum ar fi plasmă proaspătă congelată (FFP), soluție de plasmalit heparinizat sau soluții fără ser, fără componente de origine animală, este amestecat cu crioprotectori precum dimetil sulfoxid (DMSO) sau glicerol.

Peletul de probă re-lichefiat este împărțit alicote în criofiale din polipropilenă, cum ar fiCompania Suzhou Ace Biomedical Fiole de stocare criogenică.

Este important să nu umpleți în exces criofialele, deoarece acest lucru va crește riscul de fisurare și posibila eliberare a conținutului (1).

Rata de înghețare controlată

În general, o rată de înghețare controlată lentă este folosită pentru crioconservarea cu succes a celulelor.

După ce probele sunt alicote în flacoane criogenice, acestea sunt plasate pe gheață umedă sau într-un frigider de 4℃ și procedura de congelare este începută în 5 minute. Ca ghid general, celulele sunt răcite cu o viteză de la -1 la -3 pe minut (2). Acest lucru se realizează utilizând un răcitor programabil sau plasând flacoanele într-o cutie izolată plasată într-un congelator cu viteză controlată de la -70°C până la -90°C.

Transferați în azot lichid

Flacoanele criogenice congelate sunt apoi transferate într-un rezervor de azot lichid pentru perioade nedeterminate, cu condiția să se mențină o temperatură mai mică de -135℃.

Aceste temperaturi ultra-scăzute pot fi obținute prin scufundare în azotul în fază lichidă sau vaporoasă.

Faza lichida sau vaporoasa?

Se știe că depozitarea în azot în fază lichidă menține temperatura rece cu consistență absolută, dar adesea nu este recomandată din următoarele motive:

• Nevoia de volume mari (adâncime) de azot lichid care reprezintă un pericol potențial. Arsurile sau asfixierea din cauza acestui fapt reprezintă un risc real.
• Cazuri documentate de contaminare încrucișată cu agenți infecțioși, cum ar fi aspergillus, hepatitis B și răspândire virală prin mediul de azot lichid (2,3)
• Potențialul ca azotul lichid să se scurgă în flacoane în timpul imersării. Când este scos din depozit și încălzit la temperatura camerei, azotul se extinde rapid. În consecință, flaconul se poate sparge atunci când este scos din depozitul de azot lichid, creând un pericol atât din cauza resturilor zburătoare, cât și din cauza expunerii la conținut (1, 4).

Din aceste motive, depozitarea la temperaturi ultra-scăzute este cel mai frecvent în azot în fază de vapori. Atunci când probele trebuie păstrate în fază lichidă, trebuie utilizate tuburi speciale cryoflex.

Dezavantajul fazei de vapori este acela că poate apărea un gradient vertical de temperatură, ceea ce duce la fluctuații de temperatură între -135℃ și -190℃. Acest lucru necesită o monitorizare atentă și diligentă a nivelurilor de azot lichid și a variațiilor de temperatură (5).

Mulți producători recomandă ca criofialele să fie potrivite pentru depozitare până la -135℃ sau pentru utilizare numai în faza de vapori.

Dezghețați-vă celulele crioconservate

Procedura de decongelare este stresantă pentru o cultură congelată și este necesară o manipulare și o tehnică adecvată pentru a asigura viabilitatea, recuperarea și funcționalitatea optime a celulelor. Protocoalele exacte de dezghețare vor depinde de tipurile de celule specifice. Cu toate acestea, decongelarea rapidă este considerată standard pentru:

• Reduceți orice impact asupra recuperării celulare
• Ajută la reducerea timpului de expunere la substanțele dizolvate prezente în mediile de congelare
• Reduceți la minimum orice daune prin recristalizarea gheții

Băile de apă, băile de mărgele sau instrumentele automate specializate sunt utilizate în mod obișnuit pentru dezghețarea probelor.

Cel mai frecvent, 1 linie celulară este dezghețată o dată timp de 1-2 minute, rotind ușor într-o baie de apă la 37℃ până când rămâne doar o mică gheață în flacon, înainte de a fi spălate într-un mediu de creștere preîncălzit.

Pentru unele celule, cum ar fi embrionii de mamifere, încălzirea lentă este esențială pentru supraviețuirea lor.

Celulele sunt acum gata pentru cultura celulară, izolarea celulelor sau, în cazul celulelor stem hematopoietice – studii de viabilitate pentru a garanta integritatea celulelor stem donatoare înainte de terapia mieloablativă.

Este o practică normală să se preleveze alicote mici din proba prespălată utilizată pentru a efectua o numărare celulară pentru a determina concentrațiile de celule pentru placare în cultură. Apoi puteți evalua rezultatele procedurilor de izolare a celulelor și puteți determina viabilitatea celulelor.

Cele mai bune practici pentru depozitarea criovialelor

Crioconservarea cu succes a probelor stocate în criofiale depinde de multe elemente din protocol, inclusiv de depozitarea adecvată și păstrarea înregistrărilor.

• Împărțiți celulele între locațiile de stocare– Dacă volumele permit, împărțiți celulele între flacoane și depozitați-le în locații separate pentru a reduce riscul de pierdere a probei din cauza defecțiunilor echipamentului.
• Preveniți contaminarea încrucișată– Optați pentru fiole criogenice sterile de unică folosință sau autoclave înainte de utilizarea ulterioară
• Utilizați flacoane de dimensiuni adecvate pentru celulele dvs– flacoanele vin într-o gamă de volume între 1 și 5 ml. Evitați umplerea excesivă a flacoanelor pentru a reduce riscul de fisurare.
• Selectați flacoanele criogenice cu filet intern sau extern– Fiolele cu filet intern sunt recomandate de unele universități pentru măsuri de siguranță – pot preveni, de asemenea, contaminarea în timpul umplerii sau când sunt depozitate în azot lichid.
• Preveniți scurgerile- Folosiți etanșări bi-injectate turnate în capacul cu șurub sau inele O pentru a preveni scurgerile și contaminarea.
• Utilizați coduri de bare 2D și flacoane de etichete– pentru a asigura trasabilitatea, flacoanele cu suprafețe mari de scriere permit etichetarea adecvată a fiecărui flacon. Codurile de bare 2D pot ajuta la gestionarea stocării și la păstrarea înregistrărilor. Capacele cu coduri de culoare sunt utile pentru o identificare mai ușoară.
• Întreținere adecvată a depozitării- Pentru a se asigura că celulele nu se pierd, vasele de depozitare trebuie să monitorizeze constant temperatura și nivelurile de azot lichid. Alarmele ar trebui să fie montate pentru a alerta utilizatorii despre erori.

Măsuri de siguranță

Azotul lichid a devenit o practică comună în cercetarea modernă, dar prezintă riscul de vătămare gravă dacă este utilizat incorect.

Trebuie purtat echipament individual de protecție (EIP) adecvat pentru a minimiza riscul de degerături, arsuri și alte incidente adverse la manipularea azotului lichid. Purta

• Mănuși criogenice
• Haina de laborator
• Ecran complet rezistent la impact care acoperă și gâtul
• Pantofi cu vârful închis
• Șorț din plastic rezistent la stropire

Frigiderele cu azot lichid trebuie amplasate în zone bine ventilate pentru a minimiza riscul de asfixiere – azotul scăpat se vaporizează și înlocuiește oxigenul atmosferic. Magazinele cu volum mare ar trebui să aibă sisteme de alarmă cu oxigen scăzut.

Lucrul în perechi la manipularea azotului lichid este ideal și utilizarea acestuia în afara orelor normale de lucru ar trebui interzisă.

Crioviale pentru a vă sprijini fluxul de lucru

Compania Suzhou Ace Biomedical oferă o selecție largă de produse care satisfac nevoile dumneavoastră de crioconservare pentru diferite tipuri de celule. Portofoliul include o gamă de tuburi, precum și o gamă de criofiale sterile.

Criovialele noastre sunt:

• Capac cu șurub de laborator 0,5 ml 1,5 ml 2,0 ml Fiole crioviale criogenice Criotub cu fund conic cu garnitură

  ● Specificații 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml, cu fustă sau fără fustă
  ● Sunt disponibile ambele modele conice sau autoportante, sterile sau nesterile
  ● Tuburile cu capac cu filet sunt fabricate din polipropilenă de calitate medicală
  ● Flacoanele cu criotuburi PP pot fi congelate și dezghețate în mod repetat
  ●Designul capacului extern poate reduce probabilitatea de contaminare în timpul tratamentului probei.
  ● Tuburi criogenice cu capac filetat Filete universale pentru utilizare
  ● Tuburile se potrivesc cu majoritatea rotoarelor comune
  ● Tuburile criogenice cu inele O se potrivesc cu cutiile de congelare standard de 1 inch și 2 inchi, 48 de godeuri, 81 de godeuri, 96 de godeuri și 100 de godeuri
  ● Autoclavabil la 121°C și congelabil până la -86°C

  PARTEA NR	MATERIAL	VOLUM	CAPACCULOARE	buc/SAC	GENȚI/CASA
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Negru, Galben, Albastru, Roșu, Violet, Alb	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Negru, Galben, Albastru, Roșu, Violet, Alb	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Negru, Galben, Albastru, Roșu, Violet, Alb	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Negru, Galben, Albastru, Roșu, Violet, Alb	500	10