Standardizarea proceselor include optimizarea acestora și stabilirea și armonizarea ulterioară, permițând performanțe optime pe termen lung – independent de utilizator. Standardizarea asigură rezultate de înaltă calitate, precum și reproductibilitatea și comparabilitatea acestora.
Scopul PCR (clasic) este generarea unui rezultat fiabil și reproductibil. Pentru anumite aplicații, randamentulprodus PCReste de asemenea relevantă. Pentru aceste reacții, trebuie avut grijă să se asigure că probele nu sunt compromise și că fluxul de lucru PCR rămâne stabil. Mai exact, acest lucru se traduce prin reducerea la minimum a introducerii de contaminări care ar putea duce la rezultate fals pozitive sau fals negative sau chiar să inhibe reacția PCR. În plus, condițiile de reacție ar trebui să fie cât mai identice posibil pentru fiecare probă individuală dintr-o serie și, de asemenea, să fie transferabile la reacțiile ulterioare (din aceeași metodă). Aceasta se referă la compoziția reacțiilor, precum și la tipul de control al temperaturii în ciclor. Erorile utilizatorilor, desigur, trebuie evitate pe cât posibil.
Mai jos, vom demonstra provocările care sunt întâmpinate în timpul pregătirii și pe parcursul derulării unui PCR - și abordările soluțiilor care există în ceea ce privește instrumentele și consumabilele utilizate pentru standardizarea fluxurilor de lucru PCR.
Pregătirea reacției
Distribuirea componentelor de reacție în vase PCR, sau, respectiv, plăci, cuprinde multiple provocări care trebuie depășite:
Condiții de reacție
Dozarea exactă și precisă a componentelor individuale este indispensabilă atunci când se urmărește cele mai identice condiții de reacție posibile. Pe lângă o tehnică bună de pipetare, selectarea instrumentului potrivit este esențială. Master-mix-urile PCR conțin frecvent substanțe care cresc vâscozitatea sau generează spumă. În timpul procesului de pipetare, acestea conduc la umezirea substanțială avârfuri de pipetă, reducând astfel precizia de pipetare. Utilizarea sistemelor de distribuire directă sau a vârfurilor alternative de pipetă care sunt mai puțin predispuse la umezire poate îmbunătăți acuratețea și precizia procesului de pipetare.
Contaminari
În timpul procesului de distribuire, sunt generați aerosoli care, dacă sunt lăsați să ajungă în interiorul pipetei, pot contamina o altă probă în timpul următoarei etape de pipetare. Acest lucru poate fi prevenit utilizând vârfuri de filtrare sau sisteme de deplasare directă.
Consumabile precumsfaturi, vasele și plăcile care sunt utilizate în fluxul de lucru PCR nu trebuie să conțină substanțe care compromit proba sau falsifică rezultatul. Acestea includ ADN, DNazele, RNazele și inhibitorii PCR, precum și componentele care pot fi scurse din material în timpul reacției - substanțe cunoscute sub numele de leachables.
Eroare utilizator
Cu cât sunt procesate mai multe mostre, cu atât este mai mare riscul de eroare. Se poate întâmpla cu ușurință ca o probă să fie pipetată în vasul greșit sau în puțul greșit. Acest risc poate fi redus considerabil prin marcarea cu ușurință a puțurilor. Prin automatizarea etapelor de distribuire, „factorul uman”, adică erorile și variațiile legate de utilizator, sunt minimizate, crescând astfel reproductibilitatea, mai ales în cazul volumelor mici de reacție. Acest lucru necesită plăci cu o stabilitate dimensională suficientă pentru a fi utilizate într-o stație de lucru. Codurile de bare atașate oferă o lizibilitate suplimentară de către mașină, ceea ce simplifică urmărirea probelor pe parcursul întregului proces.
Programarea termociclorului
Programarea unui instrument se poate dovedi a fi consumatoare de timp, precum și predispusă la erori. Diferitele caracteristici ale termociclorului PCR lucrează împreună pentru a simplifica această etapă a procesului și, cel mai important, pentru a-l face sigur:
Operarea ușoară și îndrumarea bună a utilizatorului stau la baza programării eficiente. Pe această bază, administrarea utilizatorilor protejați cu parolă va împiedica ca propriile programe să fie modificate de către alți utilizatori. Dacă sunt în uz mai multe cicloare (de același tip), este benefic dacă un program poate fi transferat direct de la un instrument la altul prin USB sau conectivitate. Software-ul de calculator permite administrarea centrală și securizată a programelor, drepturilor utilizatorului și documentelor de pe un computer.
Executare PCR
În timpul rulării, ADN-ul este amplificat în vasul de reacție, unde fiecare probă trebuie supusă la condiții de reacție identice și consistente. Următoarele aspecte sunt relevante pentru proces:
Controlul temperaturii
Precizia excelentă în controlul temperaturii și omogenitatea blocului de ciclu sunt baza pentru condiționarea uniformă a temperaturii tuturor probelor. Calitatea înaltă a elementelor de încălzire și răcire (elemente peltier), precum și modul în care acestea sunt conectate la bloc, sunt factorii decisivi care vor determina riscul discrepanțelor de temperatură cunoscut sub numele de „efect de margine”
Evaporare
Concentrațiile componentelor individuale ale reacției nu trebuie să se modifice pe parcursul reacției din cauza evaporării. Altfel, este posibil ca foarte putinprodus PCRpoate fi generat, sau deloc. Prin urmare, este crucial să se minimizeze evaporarea prin asigurarea unei etanșări sigure. În acest caz, capacul încălzit al termociclorului și etanșarea vasului lucrează mână în mână. Sunt disponibile diferite opțiuni de etanșare pentruPlăci PCR (link: articol de etanșare), prin care cea mai bună etanșare este obținută prin etanșare termică. Alte dispozitive de închidere pot fi, de asemenea, potrivite, atâta timp cât presiunea de contact a capacului ciclorului poate fi ajustată la etanșarea selectată.
Standardizarea proceselor este în vigoare pentru a garanta rezultate precise și reproductibile pe termen lung. Aceasta include întreținerea regulată a echipamentului pentru a se asigura că acesta este întotdeauna în stare bună de funcționare. Toate consumabilele trebuie să fie de o calitate constantă înaltă în toate loturile produse, iar disponibilitatea lor fiabilă trebuie garantată.
Ora postării: 29-nov-2022