Extracția acidului nucleic și metoda mărgelelor magnetice

Introducere

Ce este extracția acidului nucleic?

În cei mai simpli termeni, extracția acidului nucleic este îndepărtarea ARN-ului și/sau ADN-ului dintr-o probă și a tot excesul care nu este necesar. Procesul de extracție izolează acizii nucleici dintr-o probă și îi dă sub formă de eluat concentrat, lipsit de diluanți și contaminanți care ar putea afecta orice aplicații din aval.

Aplicații ale extracției acidului nucleic

Acizii nucleici purificați sunt utilizați într-o multitudine de aplicații diferite, variind în mai multe industrii diferite. Asistența medicală este probabil zona în care este folosit cel mai mult, cu ARN și ADN purificat necesare pentru o serie de scopuri diferite de testare.

Aplicațiile extracției acidului nucleic în domeniul sănătății includ:

- Amplificare PCR și qPCR

- Secvențierea de generație următoare (NGS)

- Genotiparea SNP pe bază de amplificare

- Genotiparea bazată pe matrice

- Digestia cu enzime de restricție

- Analize folosind enzime modificatoare (de exemplu, ligarea și clonarea)

Există, de asemenea, alte domenii dincolo de asistența medicală în care se utilizează extracția acidului nucleic, inclusiv, dar fără a se limita la testarea paternității, criminalistica și genomica.

O scurtă istorie a extracției acidului nucleic

extragerea ADN-uluidatează de mult, prima izolare cunoscută fiind efectuată de un medic elvețian pe nume Friedrich Miescher în 1869. Miescher spera să rezolve principiile fundamentale ale vieții prin determinarea compoziției chimice a celulelor. După ce a eșuat cu limfocite, a reușit să obțină un precipitat brut de ADN din leucocite găsite în puroi pe bandajele aruncate. El a făcut acest lucru adăugând acid și apoi alcali la celulă pentru a părăsi citoplasma celulei și apoi a dezvoltat un protocol pentru a separa ADN-ul de celelalte proteine.

În urma cercetărilor inovatoare ale lui Miescher, mulți alți oameni de știință au continuat să avanseze și să dezvolte tehnici de izolare și purificare a ADN-ului. Edwin Joseph Cohn, un om de știință proteic, a dezvoltat multe tehnici de purificare a proteinelor în timpul celui de-al Doilea Război Mondial. El a fost responsabil pentru izolarea fracției de albumină serică din plasma sanguină, care este importantă în menținerea presiunii osmotice în vasele de sânge. Acest lucru a fost crucial pentru menținerea soldaților în viață.

În 1953 Francis Crick, împreună cu Rosalind Franklin și James Watson, au determinat structura ADN-ului, arătând că acesta era alcătuit din două catene de lanțuri lungi de nucleotide de acid nucleic. Această descoperire inovatoare a deschis calea pentru Meselson și Stahl, care au reușit să dezvolte un protocol de centrifugare cu gradient de densitate pentru a izola ADN-ul din bacteriile E. Coli, deoarece au demonstrat replicarea semi-conservativă a ADN-ului în timpul experimentului lor din 1958.

Tehnici de extracție a acidului nucleic

Care sunt cele 4 etape ale extragerii ADN-ului?
Toate metodele de extracție se reduc la aceiași pași fundamentali.

Perturbarea celulelor. Această etapă, cunoscută și sub denumirea de liză celulară, presupune distrugerea peretelui celular și/sau a membranei celulare, pentru a elibera fluidele intracelulare care conțin acizii nucleici de interes.

Îndepărtarea resturilor nedorite. Acestea includ lipidele membranei, proteinele și alți acizi nucleici nedoriți care pot interfera cu aplicațiile din aval.

Izolare. Există o serie de moduri diferite de a izola acizii nucleici de interes din lizatul limpezit pe care l-ați creat, care se încadrează în două categorii principale: pe bază de soluție sau în stare solidă (vezi secțiunea următoare).

Concentraţie. După ce acizii nucleici au fost izolați de toți ceilalți contaminanți și diluanți, ei sunt prezentați într-un eluat foarte concentrat.

Cele două tipuri de extracție
Există două tipuri de extracție a acidului nucleic - metode bazate pe soluție și metode în stare solidă. Metoda bazată pe soluție este cunoscută și ca metodă de extracție chimică, deoarece implică utilizarea de substanțe chimice pentru a descompune celula și a accesa materialul nucleic. Acest lucru poate fi folosind fie compuși organici, cum ar fi fenolul și cloroformul, fie compușii anorganici mai puțin nocivi și, prin urmare, mai recomandați, cum ar fi Proteinaza K sau silicagel.

Exemple de diferite metode de extracție chimică pentru a descompune o celulă includ:

- Rupere osmotică a membranei

- Digestia enzimatică a peretelui celular

- Solubilizarea membranei

- Cu detergenti

- Cu tratament alcalin

Tehnicile în stare solidă, cunoscute și sub numele de metode mecanice, implică exploatarea modului în care ADN-ul interacționează cu un substrat solid. Selectând o sferă sau o moleculă de care se va lega ADN-ul, dar nu se va lega analitul, este posibilă separarea celor două. Exemple de tehnici de extracție în fază solidă, inclusiv utilizarea de silice și margele magnetice.

Extracția mărgelelor magnetice explicată

Metoda de extracție a mărgelelor magnetice
Potențialul de extracție folosind margele magnetice a fost recunoscut pentru prima dată într-un brevet american depus de Trevor Hawkins, pentru instituția de cercetare Whitehead Institute. Acest brevet a recunoscut că este posibil să se extragă material genetic prin legarea acestora de un suport solid, care ar putea fi o mărgele magnetică. Principiul este că utilizați o perlă magnetică foarte funcționalizată pe care se va lega materialul genetic, care poate fi apoi separată de supernatant prin aplicarea unei forțe magnetice în exteriorul vasului care conține proba.

De ce să folosiți extracția de margele magnetice?
Tehnologia de extracție a mărgelelor magnetice devine din ce în ce mai răspândită, datorită potențialului pe care îl deține pentru proceduri de extracție rapide și eficiente. În ultima vreme, au existat dezvoltări ale granulelor magnetice înalt funcționalizate, cu sisteme tampon adecvate, care au făcut posibilă automatizarea extracției acidului nucleic și un flux de lucru care este foarte ușor de utilizat și eficient din punct de vedere al costurilor. De asemenea, metodele de extracție a granulelor magnetice nu implică etapele de centrifugare care pot provoca forțe de forfecare care descompun bucăți mai lungi de ADN. Aceasta înseamnă că firele mai lungi de ADN rămân intacte, ceea ce este important în testarea genomică.