Chiar dacă în teorie, o moleculă a matriței ar fi suficientă, cantități considerabil mai mari de ADN sunt utilizate în mod obișnuit pentru o PCR clasică, de exemplu, până la 1 pg de ADN genomic de mamifer și doar 1 pg de ADN plasmid. Cantitatea optimă depinde în mare măsură de numărul de copii ale secvenței țintă, precum și de complexitatea acesteia.
Dacă se utilizează foarte puțin șablon, va fi necesară o creștere corespunzătoare a numărului de cicluri de amplificare pentru a obține o cantitate suficientă de produs. O polimerază Taq care este utilizată pentru majoritatea experimentelor PCR nu prezintă o funcție de corecție (activitate exonuclează 3′-5′); astfel, erorile care apar în timpul amplificării nu pot fi corectate. Cu cât este mai mare numărul de cicluri, cu atât va fi mai răspândită amplificarea produsului defecte. Dacă, pe de altă parte, cantitatea de matriță este prea mare, probabilitatea ca primerii să se recoace cu alte secvențe (nu sută la sută complementare), precum și formarea dimerilor de primer, va crește, ceea ce va duce la amplificarea produse secundare. În multe cazuri, ADN-ul este izolat din culturi celulare sau din microorganisme și ulterior utilizat ca matriță PCR. După purificare, este necesar să se determine concentrația ADN-ului pentru a putea defini volumul necesar pentru configurarea PCR. În timp ce electroforeza pe gel de agaroză poate servi pentru a oferi o estimare, această metodă este departe de a fi exactă. Spectrofotometria UV-Vis a fost stabilită ca standard de aur pentru cuantificarea acizilor nucleici; această metodă directă și deci ușoară și rapidă măsoară absorbanța probei la 260 nm, iar concentrația este calculată cu ajutorul unui factor de conversie.
Dacă concentrația de ADN este însă foarte scăzută (< 1 µg/mL dsDNA) sau dacă este contaminat cu substanțe care absorb și în intervalul 260 nm (ex. ARN, proteine, săruri), această metodă își va atinge limitele. În cazul concentrațiilor foarte scăzute, citirile vor deveni în curând prea inexacte pentru a fi utile, iar contaminările vor duce la supraestimarea (uneori enormă) a valorii reale. În acest caz, cuantificarea prin fluorescență poate prezenta o alternativă. Această tehnică se bazează pe utilizarea unui colorant fluorescent care se leagă în mod specific de dsDNA numai complexul care cuprinde acid nucleic și colorant este excitat de lumină și, ulterior, va emite lumină cu o lungime de undă puțin mai mare. Aici, intensitatea semnalului fluorescent este proporțională cu cantitatea de ADN, iar pentru determinarea concentrației se evaluează în raport cu o curbă standard. Avantajele acestei metode se bazează pe specificitatea legăturii, care exclude influențele externe introduse de contaminare, precum și pe capacitatea rezultată de a detecta concentrații foarte scăzute de ADN. Adecvarea oricărei metode depinde în principal de concentrația și puritatea probei; în multe cazuri poate fi chiar recomandabil să se aplice ambele metode în paralel.
Ora postării: 30-nov-2022