Criotubossão comumente usados ​​para o armazenamento criogênico de linhas celulares e outros materiais biológicos críticos, em Dewars cheios de nitrogênio líquido.

Existem vários estágios envolvidos na preservação bem-sucedida das células em nitrogênio líquido. Embora o princípio básico seja um congelamento lento, a técnica exata empregada depende do tipo de célula e do crioprotetor utilizado. Existem várias considerações de segurança e práticas recomendadas a serem levadas em consideração ao armazenar células em temperaturas tão baixas.

Esta postagem tem como objetivo dar uma visão geral de como os criotubos são armazenados em nitrogênio líquido.

O que são criotubos

Os criotubos são frascos pequenos e tampados projetados para armazenar amostras líquidas em temperaturas extremamente baixas. Eles garantem que as células preservadas no crioprotetor não entrem em contato direto com o nitrogênio líquido, minimizando o risco de fraturas celulares e ainda se beneficiando do efeito de resfriamento extremo do nitrogênio líquido.

Os frascos geralmente estão disponíveis em diversos volumes e designs – podem ser rosqueados interna ou externamente com fundo plano ou arredondado. Formatos estéreis e não estéreis também estão disponíveis.

Quem usaCyroviaisarmazenar células em nitrogênio líquido

Uma série de laboratórios privados e do NHS, bem como instituições de investigação especializadas em bancos de sangue do cordão umbilical, biologia de células epiteliais, imunologia e biologia de células estaminais utilizam criotubos para criopreservar células.

As células preservadas desta forma incluem células B e T, células CHO, células estaminais e progenitoras hematopoiéticas, hibridomas, células intestinais, macrófagos, células estaminais e progenitoras mesenquimais, monócitos, mieloma, células NK e células estaminais pluripotentes.

Visão geral de como armazenar criotubos em nitrogênio líquido

A criopreservação é um processo que preserva células e outras construções biológicas, resfriando-as a temperaturas muito baixas. As células podem ser armazenadas em nitrogênio líquido por anos sem perda de viabilidade celular. Este é um resumo dos procedimentos empregados.

Preparação Celular

O método exato para preparar amostras irá variar dependendo do tipo de célula, mas em geral, as células são coletadas e centrifugadas para desenvolver um pellet rico em células. Este sedimento é então ressuspenso no sobrenadante misturado com crioprotetor ou meio de criopreservação.

Meio de Criopreservação

Este meio é empregado para preservar as células nos ambientes de baixa temperatura a que serão submetidas, inibindo a formação de cristais intra e extracelulares e, consequentemente, a morte celular. Seu papel é fornecer um ambiente seguro e protetor para células e tecidos durante os processos de congelamento, armazenamento e descongelamento.

Um meio como plasma fresco congelado (FFP), solução de plasmalyte heparinizada ou soluções isentas de soro e sem componentes animais é misturado com crioprotetores como dimetilsulfóxido (DMSO) ou glicerol.

O pellet de amostra reliquefeito é dividido em alíquotas em frascos criogênicos de polipropileno, comoFrascos de armazenamento criogênico da empresa Suzhou Ace Biomedical.

É importante não encher demais os frascos criogênicos, pois isso aumentará o risco de rachaduras e a possível liberação do conteúdo (1).

Taxa de congelamento controlada

Em geral, uma taxa de congelamento lenta e controlada é empregada para o sucesso da criopreservação das células.

Depois que as amostras são divididas em alíquotas em frascos criogênicos, elas são colocadas em gelo úmido ou em uma geladeira a 4°C e o procedimento de congelamento é iniciado em 5 minutos. Como orientação geral, as células são resfriadas a uma taxa de -1 a -3 por minuto (2). Isto é conseguido usando um resfriador programável ou colocando os frascos em uma caixa isolada colocada em um freezer com taxa controlada de –70°C a –90°C.

Transferência para nitrogênio líquido

Os frascos criogênicos congelados são então transferidos para um tanque de nitrogênio líquido por períodos indefinidos, desde que seja mantida uma temperatura inferior a -135°C.

Essas temperaturas ultrabaixas podem ser obtidas por imersão em nitrogênio líquido ou em fase de vapor.

Fase líquida ou vapor?

O armazenamento em nitrogênio em fase líquida é conhecido por manter a temperatura fria com consistência absoluta, mas muitas vezes não é recomendado pelos seguintes motivos:

• A necessidade de grandes volumes (profundidade) de nitrogênio líquido, que é um perigo potencial. Queimaduras ou asfixia devido a isso são um risco real.
• Casos documentados de contaminação cruzada por agentes infecciosos como aspergillus, hepatite B e propagação viral através do meio de nitrogênio líquido (2,3)
• O potencial de vazamento de nitrogênio líquido nos frascos durante a imersão. Quando retirado do armazenamento e aquecido à temperatura ambiente, o nitrogênio se expande rapidamente. Consequentemente, o frasco pode quebrar quando removido do armazenamento de nitrogênio líquido, criando um perigo tanto por detritos voadores quanto pela exposição ao conteúdo (1, 4).

Por essas razões, o armazenamento em temperatura ultrabaixa é mais comumente em nitrogênio em fase de vapor. Quando as amostras devem ser armazenadas na fase líquida, deve ser utilizado tubo crioflexo especializado.

A desvantagem da fase de vapor é que pode ocorrer um gradiente vertical de temperatura, resultando em flutuações de temperatura entre -135°C e -190°C. Isto requer um monitoramento cuidadoso e diligente dos níveis de nitrogênio líquido e das variações de temperatura (5).

Muitos fabricantes recomendam que os criotubos sejam adequados para armazenamento até -135°C ou para uso apenas na fase de vapor.

Descongelando suas células criopreservadas

O procedimento de descongelamento é estressante para uma cultura congelada, e manuseio e técnica adequados são necessários para garantir viabilidade, recuperação e funcionalidade ideais das células. Os protocolos exatos de descongelamento dependerão de tipos específicos de células. No entanto, o descongelamento rápido é considerado padrão para:

• Diminua qualquer impacto na recuperação celular
• Ajuda a reduzir o tempo de exposição aos solutos presentes no meio de congelamento
• Minimize qualquer dano por recristalização de gelo

Banhos-maria, banhos de esferas ou instrumentos automatizados especializados são comumente usados ​​para descongelar amostras.

Mais frequentemente, 1 linhagem celular é descongelada por vez durante 1-2 minutos, girando suavemente em banho-maria a 37°C até que reste apenas um pequeno pedaço de gelo no frasco antes de serem lavadas em meio de crescimento pré-aquecido.

Para algumas células, como os embriões de mamíferos, o aquecimento lento é essencial para a sua sobrevivência.

As células estão agora prontas para cultura celular, isolamento celular ou, no caso de células estaminais hematopoiéticas – estudos de viabilidade para garantir a integridade das células estaminais doadoras antes da terapia mieloablativa.

É prática normal retirar pequenas alíquotas da amostra pré-lavada usada para realizar uma contagem de células para determinar as concentrações de células para plaqueamento em cultura. Você pode então avaliar os resultados dos procedimentos de isolamento celular e determinar a viabilidade celular.

Melhores práticas para armazenamento de criotubos

O sucesso da criopreservação de amostras armazenadas em criotubos depende de muitos elementos do protocolo, incluindo armazenamento adequado e manutenção de registros.

• Dividir células entre locais de armazenamento– Se os volumes permitirem, divida as células entre os frascos e armazene-as em locais separados para reduzir o risco de perda de amostras devido a falhas do equipamento.
• Evitar contaminação cruzada– Opte por frascos criogênicos estéreis de uso único ou autoclave antes do uso subsequente
• Use frascos de tamanho apropriado para suas células– os frascos vêm em uma faixa de volumes entre 1 e 5mls. Evite encher demais os frascos para reduzir o risco de rachaduras.
• Selecione frascos criogênicos com rosca interna ou externa– Frascos com rosca interna são recomendados por algumas universidades por medidas de segurança – eles também podem evitar a contaminação durante o enchimento ou quando armazenados no nitrogênio líquido.
• Evitar vazamento- Use vedações bi-injetadas moldadas na tampa de rosca ou nos O-rings para evitar vazamentos e contaminação.
• Use códigos de barras 2D e frascos de rótulos– para garantir a rastreabilidade, os frascos com grandes áreas de escrita permitem que cada frasco seja devidamente rotulado. Os códigos de barras 2D podem ajudar no gerenciamento de armazenamento e na manutenção de registros. As tampas codificadas por cores são úteis para facilitar a identificação.
• Manutenção adequada do armazenamento- Para garantir que as células não se perdem, os recipientes de armazenamento devem monitorizar constantemente a temperatura e os níveis de azoto líquido. Alarmes devem ser instalados para alertar os usuários sobre erros.

Precauções de segurança

O nitrogênio líquido tornou-se uma prática comum na pesquisa moderna, mas apresenta o risco de lesões graves se usado incorretamente.

Deve-se usar equipamento de proteção individual (EPI) adequado para minimizar o risco de congelamento, queimaduras e outros incidentes adversos ao manusear nitrogênio líquido. Vestir

• Luvas criogênicas
• Jaleco de laboratório
• Protetor facial completo resistente a impactos que também cobre o pescoço
• Sapatos fechados
• Avental de plástico à prova de respingos

Os refrigeradores de nitrogênio líquido devem ser colocados em áreas bem ventiladas para minimizar o risco de asfixia – o nitrogênio escapado vaporiza e desloca o oxigênio atmosférico. Armazéns de grande volume devem ter sistemas de alarme de baixo nível de oxigênio.

Trabalhar em dupla no manuseio do nitrogênio líquido é ideal e seu uso fora do horário normal de trabalho deve ser proibido.

Criotubos para apoiar seu fluxo de trabalho

A empresa Suzhou Ace Biomedical oferece uma ampla seleção de produtos que atendem às suas necessidades de criopreservação para diferentes tipos de células. O portfólio inclui uma variedade de tubos, bem como uma variedade de criotubos estéreis.

Nossos criotubos são:

• Tampa de parafuso de laboratório 0,5mL 1,5mL 2,0mL criotubo criogênico frascos criotubos de fundo cônico com junta

  ● Especificação de 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml, com saia ou sem saia
  ● Design cônico ou independente, estéril ou não estéril estão disponíveis
  ● Os tubos com tampa de rosca são feitos de polipropileno de grau médico
  ● Os frascos de criotubos PP podem ser repetidamente congelados e descongelados
  ●O design da tampa externa pode reduzir a probabilidade de contaminação durante o tratamento da amostra.
  ● Tubos criogênicos com tampa de rosca Roscas universais para uso
  ● Os tubos se adaptam aos rotores mais comuns
  ● Os tubos o-ring de tubo criogênico cabem em caixas de freezer padrão de 1 polegada e 2 polegadas, 48 ​​poços, 81 poços, 96 poços e 100 poços
  ● Autoclavável até 121°C e congelável até -86°C

  PARTE NÃO	MATERIAL	VOLUME	PACCOR	PCS/BOLSA	SACOS/CASO
  ACT05-BL-N	PP	0,5ML	Preto, amarelo, azul, vermelho, roxo, branco	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5ML	Preto, amarelo, azul, vermelho, roxo, branco	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5ML	Preto, amarelo, azul, vermelho, roxo, branco	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0ML	Preto, amarelo, azul, vermelho, roxo, branco	500	10