A padronização de processos inclui a sua otimização e posterior estabelecimento e harmonização, permitindo um desempenho ideal a longo prazo – independente do usuário. A padronização garante resultados de alta qualidade, bem como sua reprodutibilidade e comparabilidade.
O objetivo da PCR (clássica) é a geração de um resultado confiável e reprodutível. Para certas aplicações, o rendimento doProduto PCRtambém é relevante. Para estas reações, deve-se ter cuidado para garantir que as amostras não sejam comprometidas e que o fluxo de trabalho da PCR permaneça estável. Especificamente, isto se traduz em minimizar a introdução de contaminações que poderiam levar a resultados falsos positivos ou falsos negativos ou mesmo inibir a reação PCR. Além disso, as condições de reação devem ser tão idênticas quanto possível para cada amostra individual de uma corrida e também ser transferíveis para reações subsequentes (do mesmo método). Isto se refere à composição das reações, bem como ao tipo de controle de temperatura no ciclador. Os erros do usuário, é claro, devem ser evitados tanto quanto possível.
A seguir, demonstraremos os desafios encontrados durante a preparação e durante a execução de uma PCR – e as abordagens para soluções que existem em relação aos instrumentos e consumíveis utilizados para a padronização dos fluxos de trabalho da PCR.
Preparação da reação
A distribuição dos componentes da reação em recipientes de PCR, ou placas, respectivamente, compreende múltiplos desafios que devem ser superados:
Condições de reação
A dosagem exata e precisa dos componentes individuais é indispensável quando se busca condições de reação mais idênticas possíveis. Além de uma boa técnica de pipetagem, é fundamental selecionar a ferramenta certa. As master mixes de PCR frequentemente contêm substâncias que aumentam a viscosidade ou geram espuma. Durante o processo de pipetagem, estes levam a um molhamento substancial dopontas de pipeta, reduzindo assim a precisão da pipetagem. O uso de sistemas de distribuição direta ou pontas de pipetas alternativas que são menos propensas a molhar podem melhorar a exatidão e a precisão do processo de pipetagem.
Contaminações
Durante o processo de dispensação, são gerados aerossóis que, se atingirem o interior da pipeta, podem potencialmente contaminar outra amostra durante a próxima etapa de pipetagem. Isto pode ser evitado usando pontas de filtro ou sistemas de deslocamento direto.
Consumíveis comopontas, os recipientes e as placas utilizados no fluxo de trabalho da PCR não devem conter substâncias que comprometam a amostra ou falsifiquem o resultado. Estes incluem DNA, DNases, RNases e inibidores de PCR, bem como componentes que podem potencialmente ser lixiviados do material durante a reação – substâncias conhecidas como lixiviáveis.
Erro do usuário
Quanto mais amostras forem processadas, maior será o risco de erro. Pode facilmente acontecer que uma amostra seja pipetada para o recipiente errado ou para o poço errado. Este risco pode ser consideravelmente reduzido através de uma marcação facilmente discernível dos poços. Através da automatização das etapas de distribuição, o “fator humano”, ou seja, erros e variações relacionadas ao usuário, são minimizados, aumentando assim a reprodutibilidade, especialmente no caso de pequenos volumes de reação. Isto requer placas com estabilidade dimensional suficiente para serem empregadas em uma estação de trabalho. Os códigos de barras anexados fornecem legibilidade adicional por máquina, o que simplifica o rastreamento de amostras durante todo o processo.
Programação do termociclador
Programar um instrumento pode ser demorado e sujeito a erros. Diferentes recursos do termociclador PCR trabalham juntos para simplificar esta etapa do processo e, o mais importante, para torná-lo seguro:
A operação fácil e a boa orientação do usuário são a base de uma programação eficiente. Com base nesta base, a administração de usuários protegida por senha impedirá que os próprios programas sejam alterados por outros usuários. Se vários cicladores (do mesmo tipo) estiverem em uso, será benéfico se um programa puder ser transferido diretamente de um instrumento para outro via USB ou conectividade. O software de computador permite a administração central e segura de programas, direitos de usuário e documentos em um computador.
Execução de PCR
Durante a corrida, o DNA é amplificado no recipiente de reação, onde cada amostra deve ser submetida a condições de reação idênticas e consistentes. Os seguintes aspectos são relevantes para o processo:
Controle de temperatura
A excelente precisão no controle de temperatura e a homogeneidade do bloco ciclador são a base para o condicionamento uniforme da temperatura de todas as amostras. A elevada qualidade dos elementos de aquecimento e arrefecimento (elementos Peltier), bem como a forma como estes estão ligados ao bloco, são os factores decisivos que determinarão o risco de discrepâncias de temperatura conhecidas como “efeito de borda”.
Evaporação
As concentrações dos componentes individuais da reação não devem mudar ao longo da reação devido à evaporação. Caso contrário, é possível que muito poucoProduto PCRpode ser gerado, ou nenhum. Portanto, é crucial minimizar a evaporação, garantindo uma vedação segura. Neste caso, a tampa aquecida do termociclador e a vedação do recipiente trabalham de mãos dadas. Diferentes opções de vedação estão disponíveis paraPlacas PCR (link: Artigo de vedação), onde a melhor vedação é obtida através da vedação térmica. Outros fechos também podem ser adequados, desde que a pressão de contato da tampa do ciclador possa ser ajustada à vedação selecionada.
A padronização do processo está em vigor para salvaguardar resultados precisos e reprodutíveis a longo prazo. Isto inclui a manutenção regular do equipamento para garantir que esteja sempre em boas condições de funcionamento. Todos os consumíveis devem ser de qualidade consistentemente elevada em todos os lotes produzidos e a sua disponibilidade fiável deve ser garantida.
Horário da postagem: 29 de novembro de 2022