Introdução
O que é extração de ácido nucleico?
Nos termos mais simples, a extração do ácido nucleico é a remoção do RNA e/ou DNA de uma amostra e todo o excesso que não é necessário. O processo de extração isola os ácidos nucleicos de uma amostra e os produz na forma de um eluato concentrado, livre de diluentes e contaminantes que podem afetar qualquer aplicação a jusante.
Aplicações da extração de ácido nucleico
Os ácidos nucleicos purificados são usados em uma infinidade de aplicações diferentes, variando em várias indústrias diferentes. A assistência médica é talvez a área em que mais é usada, com RNA e DNA purificados necessários para uma série de diferentes fins de teste.
As aplicações da extração de ácido nucleico nos cuidados de saúde incluem:
- Sequenciamento de próxima geração (NGS)
- genotipagem SNP baseada em amplificação
- Genotipagem baseada em matriz
- Digestão da enzima de restrição
- Análises usando enzimas modificadoras (por exemplo, ligação e clonagem)
Existem também outros campos além dos cuidados de saúde, onde a extração de ácido nucleico é usado, incluindo, entre outros, testes de paternidade, forense e genômica.
Uma breve história de extração de ácido nucleico
Extração de DNAData um longo caminho, com o primeiro isolamento conhecido sendo realizado por um médico suíço chamado Friedrich Miescher em 1869. Miescher esperava resolver os princípios fundamentais da vida, determinando a composição química das células. Depois de falhar nos linfócitos, ele conseguiu obter um precipitado bruto de DNA de leucócitos encontrados em pus em bandagens descartadas. Ele fez isso adicionando ácido e alcalino à célula para deixar o citoplasma da célula e depois desenvolveu um protocolo para separar o DNA das outras proteínas.
Após a pesquisa inovadora de Miescher, muitos outros cientistas avançaram e desenvolveram técnicas para isolar e purificar o DNA. Edwin Joseph Cohn, um cientista de proteínas desenvolveu muitas técnicas para purificação de proteínas durante a Segunda Guerra Mundial. Ele foi responsável por isolar a fração de albumina sérica do plasma sanguíneo, o que é importante na manutenção da pressão osmótica nos vasos sanguíneos. Isso foi crucial para manter os soldados vivos.
Em 1953, Francis Crick, juntamente com Rosalind Franklin e James Watson, determinaram a estrutura do DNA, mostrando que era composto por dois fios de longas cadeias de nucleotídeos de ácido nucleico. Essa descoberta inovadora abriu o caminho para Meselson e Stahl, que foram capazes de desenvolver um protocolo de centrifugação de gradiente de densidade para isolar o DNA das bactérias E. coli, pois demonstraram a replicação semi-conservadora do DNA durante seu experimento de 1958.
Técnicas de extração de ácido nucleico
Quais são os 4 estágios da extração de DNA?
Todos os métodos de extração se resumem às mesmas etapas fundamentais.
Interrupção da célula. Esse estágio, também conhecido como lise celular, envolve quebrar a parede celular e/ou a membrana celular, em ordem liberar os fluidos intra-celulares contendo os ácidos nucleicos de interesse.
Remoção de detritos indesejados. Isso inclui lipídios de membrana, proteínas e outros ácidos nucleicos indesejados que podem interferir nas aplicações a jusante.
Isolamento. Existem várias maneiras diferentes de isolar os ácidos nucleicos de interesse do lisado limpo que você criou, que se enquadra entre duas categorias principais: estado baseado em solução ou estado sólido (consulte a próxima seção).
Concentração. Depois que os ácidos nucleicos foram isolados de todos os outros contaminantes e diluentes, eles são apresentados em um eluato altamente concentrado.
Os dois tipos de extração
Existem dois tipos de extração de ácido nucleico - métodos baseados em solução e métodos de estado sólido. O método baseado em solução também é conhecido como método de extração química, pois envolve o uso de produtos químicos para quebrar a célula e acessar o material nucleico. Isso pode estar usando compostos orgânicos, como fenol e clorofórmio, ou os compostos inorgânicos menos prejudiciais e, portanto, mais recomendados, como a proteinase K ou o gel de sílica.
Exemplos de diferentes métodos de extração química para quebrar uma célula incluem:
- Ruptura osmótica da membrana
- Digestão enzimática da parede celular
- Solubilização da membrana
- com detergentes
- com tratamento alcalino
As técnicas de estado sólido, também conhecidas como métodos mecânicos, envolvem a exploração de como o DNA interage com um substrato sólido. Ao selecionar uma conta ou molécula na qual o DNA se ligará, mas o analito não, é possível separar os dois. Exemplos de técnicas de extração em fase sólida, incluindo o uso de sílica e contas magnéticas.
Extração de contas magnéticas explicada
O método de extração de contas magnéticas
O potencial de extração usando contas magnéticas foi reconhecido pela primeira vez em uma patente dos EUA apresentada por Trevor Hawkins, para a instituição de pesquisa do Whitehead Institute. Essa patente reconheceu que era possível extrair material genético, ligando -os a um sólido portador de suporte, que poderia ser um cordão magnético. O princípio é que você usa um cordão magnético altamente funcionalizado no qual o material genético se ligará, que pode ser separado do sobrenadante, aplicando uma força magnética à parte externa do vaso segurando a amostra.
Por que usar extração de contas magnéticas?
A tecnologia de extração de contas magnética está se tornando cada vez mais prevalente, devido ao potencial que ela mantém para procedimentos de extração rápidos e eficientes. Nos últimos tempos, houve desenvolvimentos de contas magnéticas altamente funcionalizadas com sistemas de tampão adequados, que tornaram possível a automação da extração de ácido nucleico e um fluxo de trabalho que é muito leve e econômico. Além disso, os métodos de extração de contas magnéticos não envolvem as etapas de centrifugação que podem causar forças de cisalhamento que quebram peças mais longas de DNA. Isso significa que os fios mais longos de DNA permanecem intactos, o que é importante nos testes de genômica.
Hora de postagem: novembro-25-2022