څومره ټیمپلیټ باید زما د PCR عکس العمل ته اضافه کړو؟

که څه هم په تیوري کې، د ټیمپلیټ یو مالیکول به کافي وي، د پام وړ لوی مقدار DNA معمولا د کلاسیک PCR لپاره کارول کیږي، د بیلګې په توګه، تر 1 µg پورې د جینومیک تی لرونکو DNA او لږ تر لږه 1 pg پلازمیډ DNA. مطلوب مقدار په پراخه کچه د هدف ترتیب د نقلونو په شمیر او همدارنګه د هغې پیچلتیا پورې اړه لري.

که چیرې خورا لږ ټیمپلیټ وکارول شي ، د کافي مقدار محصول ترلاسه کولو لپاره به د امپلیفیکیشن دورې په شمیر کې ورته زیاتوالی ته اړتیا وي. د تاق پولیمریز چې د ډیری PCR تجربو لپاره کارول کیږي د سمون فعالیت نه لري (3′-5′ exonuclease فعالیت)؛ په دې توګه، د امپلیفیکیشن په جریان کې پیښیږي غلطی نشي سم کیدی. هرڅومره چې د سایکلونو شمیر لوړ وي ، هومره به د غلط محصول پراخه کول خورا پراخه وي. که له بلې خوا، د ټیمپلیټ اندازه خورا لوړه وي، د پرائمرونو د انیل کولو احتمال د نورو (نه سل په سلو کې بشپړونکي) ترتیبونو ته، او همدارنګه د پرائمر ډیمرونو رامینځته کیدو احتمال به ډیر شي، چې پایله به یې د پراخوالي سبب شي. ضمني محصولات په ډیرو مواردو کې، DNA د حجرو کلتورونو یا مایکرو ارګانیزمونو څخه جلا کیږي او وروسته د PCR ټیمپلیټ په توګه کارول کیږي. د پاکولو وروسته، دا اړینه ده چې د DNA غلظت وټاکئ ترڅو د PCR ترتیب لپاره اړین حجم تعریف کړي. پداسې حال کې چې د اګاروز جیل الیکٹروفورسیس ممکن د اټکل چمتو کولو لپاره خدمت وکړي، دا طریقه د دقیق څخه لرې ده. UV-Vis spectrophotometry د نیوکلیک اسیدونو اندازه کولو لپاره د سرو زرو معیار په توګه تاسیس شوی؛ دا مستقیم او له همدې امله اسانه او چټک میتود په 260 nm کې د نمونې جذب اندازه کوي، او غلظت د تبادلې فکتور په مرسته محاسبه کیږي.

که چیرې د DNA غلظت خورا ټیټ وي، مګر (<1 µg/mL dsDNA)، یا که دا د هغو موادو سره ککړ وي چې د 260 nm رینج کې جذب شوي وي (د بیلګې په توګه RNA، پروټین، مالګې)، دا طریقه به خپل حد ته ورسیږي. د خورا ټیټ غلظت په حالت کې ، لوستل به ډیر ژر د کارولو لپاره خورا غلط شي ، او ککړتیا به د ریښتیني ارزښت (کله ناکله خورا لوی) اندازې لامل شي. په دې حالت کې، د فلوروسینس په کارولو سره اندازه کول ممکن یو بدیل وړاندې کړي. دا تخنیک د فلوروسینټ رنګ کارولو پراساس دی چې په ځانګړي ډول dsDNA پورې تړلی دی یوازې هغه پیچلي چې نیوکلیک اسید او رنګ لري د رڼا لخوا هڅول کیږي، او دا به وروسته د یو څه لوړ طول موج رڼا خپروي. دلته، د فلوروسینټ سیګنال شدت د DNA مقدار سره متناسب دی، او د غلظت ټاکلو لپاره دا د معیاري منحني په تړاو ارزول کیږي. د دې میتود ګټې د بانډ په ځانګړتیا پورې اړه لري ، کوم چې د ککړتیا لخوا معرفي شوي بهرني تاثیرات خارجوي ، په بیله بیا د DNA خورا ټیټ غلظت کشف کولو پایله کې وړتیا. د هرې میتود مناسبیت په عمده توګه د نمونې غلظت او پاکوالي پورې اړه لري؛ په ډیری قضیو کې دا ممکن حتی مشوره وي چې دواړه میتودونه په موازي ډول پلي کړئ.