Aby reakcje amplifikacji przebiegły pomyślnie, konieczne jest, aby w każdym preparacie poszczególne składniki reakcji występowały w odpowiednim stężeniu. Ponadto ważne jest, aby nie doszło do skażenia.
Zwłaszcza, gdy trzeba przygotować wiele reakcji, zamiast pipetować każdy odczynnik oddzielnie do każdego naczynia, zaleca się przygotowanie tak zwanej mieszaniny głównej. Na rynku dostępne są wstępnie skonfigurowane mieszanki, do których dodaje się wyłącznie składniki specyficzne dla próbki (podkład) i wodę. Alternatywnie master mix można przygotować samodzielnie. W obu wariantach mieszaninę rozprowadza się do każdego naczynia PCR bez matrycy i na końcu dodaje się pojedynczą próbkę DNA.
Stosowanie mastermiksu ma kilka zalet: Po pierwsze, zmniejsza się liczba pojedynczych etapów pipetowania. W ten sposób minimalizowane jest zarówno ryzyko błędów użytkownika podczas pipetowania, jak i ryzyko zanieczyszczenia, a także oczywiście oszczędza się czas. Zasadniczo dokładność pipetowania jest również większa, ponieważ dozowane są większe objętości. Łatwo to zrozumieć, sprawdzając dane techniczne pipet: im mniejsza dozowana objętość, tym większe mogą być odchylenia. Fakt, że wszystkie preparaty pochodzą z tego samego naczynia, pozytywnie wpływa na jednorodność (jeśli jest dobrze wymieszany). Poprawia to również powtarzalność eksperymentów.
Przygotowując master mix należy dodać co najmniej 10% dodatkowej objętości (np. jeśli potrzeba 10 preparatów, przelicz na podstawie 11), tak aby nawet ostatnie naczynie zostało prawidłowo napełnione. W ten sposób można skompensować (niewielkie) niedokładności pipetowania i efekt utraty próbki podczas dozowania roztworów zawierających detergent. Detergenty zawarte są w roztworach enzymów, takich jak polimerazy i mastermiksy, powodując tworzenie się piany i osadów na wewnętrznej powierzchni zwykłychkońcówki do pipet.
W zależności od zastosowania i rodzaju dozowanej cieczy należy wybrać właściwą technikę pipetowania (1) i odpowiedni sprzęt. W przypadku roztworów zawierających detergenty zaleca się stosowanie systemu bezpośredniego wyporu lub tzw. końcówek do pipet o „niskiej retencji” jako alternatywy dla pipet z poduszką powietrzną. EfektKońcówka do pipet ACEopiera się na szczególnie hydrofobowej powierzchni. Płyny zawierające detergenty nie pozostawiają osadu wewnątrz i na zewnątrz, dzięki czemu można zminimalizować utratę roztworu.
Oprócz dokładnego dozowania wszystkich składników ważne jest również, aby nie doszło do skażenia preparatów. Nie wystarczy użycie materiałów eksploatacyjnych o wysokiej czystości, ponieważ w procesie pipetowania w pipecie z poduszką powietrzną mogą powstawać aerozole, które pozostają w pipecie. DNA, które może znajdować się w aerozolu, może zostać przeniesione z jednej próbki do drugiej w kolejnym etapie pipetowania, co może doprowadzić do skażenia. Wspomniane powyżej systemy bezpośredniego wyporu mogą również zminimalizować to ryzyko. W przypadku pipet z poduszką powietrzną sensowne jest użycie końcówek z filtrem w celu ochrony stożka pipety poprzez zatrzymanie rozprysków, aerozoli i biomolekuł.
Czas publikacji: 6 grudnia 2022 r