W przypadku pomyślnych reakcji amplifikacji konieczne jest, aby poszczególne składniki reakcji były obecne w prawidłowym stężeniu w każdym przygotowaniu. Ponadto ważne jest, aby nie nastąpić zanieczyszczenie.
Zwłaszcza gdy należy skonfigurować wiele reakcji, ustalono, aby przygotować tak zwaną mieszankę główną zamiast pipporować każdy odczynnik osobno do każdego naczynia. Zamieszkania wstępnie skonfigurowane są dostępne w handlu, w których dodaje się tylko komponenty specyficzne dla próbki (starter) i woda. Alternatywnie Master Mix można samodzielnie przygotować. W obu wariantach mieszanina jest rozkładana do każdego naczynia PCR bez szablonu, a poszczególna próbka DNA jest dodawana osobno na końcu.
Korzystanie z mieszanki głównej ma kilka zalet: po pierwsze, liczba pojedynczych kroków pipetowych jest zmniejszona. W ten sposób zarówno ryzyko błędów użytkownika podczas pipetowania, jak i ryzyko zanieczyszczenia są zminimalizowane i oczywiście czas jest oszczędzany. Zasadniczo dokładność pipetowania jest również wyższa, ponieważ większe objętości są dawkowane. Jest to łatwe do zrozumienia podczas sprawdzania danych technicznych pipet: im mniejsza objętość dawkowania, tym wyższe mogą być odchylenia. Fakt, że wszystkie preparaty pochodzą z tego samego naczynia, ma pozytywny wpływ na jednorodność (jeśli dobrze mieszane). Poprawia to również odtwarzalność eksperymentów.
Podczas przygotowywania mieszanki głównej należy dodać co najmniej 10 % dodatkowej objętości (np. Jeśli wymagane jest 10 preparatów, oblicz na podstawie 11), aby nawet ostatnio wypełniło się ostatnio. W ten sposób (niewielkie) pipetowanie niedokładności i wpływ utraty próbki podczas roztworów zawierających detergenty można zrekompensować. Detergenty są zawarte w roztworach enzymatycznych, takich jak polimerazy i mieszanki główne, powodując tworzenie się piany i reszty na wewnętrznej powierzchni normalnejWskazówki pipety.
W zależności od zastosowania i rodzaju płynu do wydawania należy wybrać prawidłową technikę pipetowania (1), a wybrano odpowiedni sprzęt. W przypadku roztworów zawierających detergenty zaleca się bezpośrednie przemieszczenie lub tak zwane pipety „niskiej retencji” jako alternatywę dla pipet z powietrzem. EfektWskazówka pipety ACEopiera się na szczególnie hydrofobowej powierzchni. Płyty zawierające detergenty nie pozostawiają filmu pozostałości po wewnętrznej i zewnętrznej stronie, aby można było zminimalizować utratę roztworu.
Oprócz dokładnego dawkowania wszystkich elementów, ważne jest również, aby nie nastąpiło zanieczyszczenie preparatów. Nie wystarczy użyć materiałów eksploatacyjnych o dużej czystości, ponieważ proces pipetowania w pipecie z poduszki powietrznej może wytwarzać aerozole, które pozostały w pipecie. DNA, które może być zawarte w aerozolu, można przenieść z jednej próbki do następnego na następnym etapie pipetowania, a tym samym prowadzić do zanieczyszczenia. Wspomniane powyżej systemy bezpośrednie przemieszczenia mogą również zminimalizować to ryzyko. W przypadku pipet powietrznych sensowne jest użycie końcówek filtrów w celu ochrony stożka pipetowego poprzez zachowanie plam, aerozoli i biomolekuł.
Czas po: grudzień 06-2022