Kriofiolkisą powszechnie stosowane do kriogenicznego przechowywania linii komórkowych i innych krytycznych materiałów biologicznych w Dewarach wypełnionych ciekłym azotem.

Na pomyślną konserwację komórek w ciekłym azocie składa się kilka etapów. Chociaż podstawową zasadą jest powolne zamrażanie, dokładna zastosowana technika zależy od rodzaju komórek i użytego krioprotektanta. Podczas przechowywania ogniw w tak niskich temperaturach należy wziąć pod uwagę kilka względów bezpieczeństwa i najlepszych praktyk.

Celem tego postu jest omówienie sposobu przechowywania kriofiolek w ciekłym azocie.

Co to są kriofiolki

Kriofiolki to małe, zakorkowane fiolki przeznaczone do przechowywania próbek cieczy w ekstremalnie niskich temperaturach. Zapewniają, że komórki zakonserwowane w krioprotektantze nie wejdą w bezpośredni kontakt z ciekłym azotem, minimalizując ryzyko pękania komórek, a jednocześnie korzystając z ekstremalnie chłodzącego efektu ciekłego azotu.

Fiolki są zwykle dostępne w różnych pojemnościach i wzorach – mogą być gwintowane wewnętrznie lub zewnętrznie, z płaskim lub zaokrąglonym dnem. Dostępne są również formaty sterylne i niesterylne.

Kto używaCyrowialedo przechowywania komórek w ciekłym azocie

Szereg laboratoriów NHS i prywatnych, a także instytucji badawczych specjalizujących się w bankowaniu krwi pępowinowej, biologii komórek nabłonkowych, immunologii i biologii komórek macierzystych wykorzystuje kriofiolki do kriokonserwacji komórek.

Do komórek zakonserwowanych w ten sposób należą komórki B i T, komórki CHO, hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe, hybrydomy, komórki jelitowe, makrofagi, mezenchymalne komórki macierzyste i progenitorowe, monocyty, szpiczak, komórki NK i pluripotencjalne komórki macierzyste.

Omówienie sposobu przechowywania kriofiolek w ciekłym azocie

Kriokonserwacja to proces, który konserwuje komórki i inne konstrukcje biologiczne poprzez schładzanie ich do bardzo niskich temperatur. Komórki można przechowywać w ciekłym azocie przez lata bez utraty żywotności. Oto zarys stosowanych procedur.

Przygotowanie komórek

Dokładna metoda przygotowania próbek będzie się różnić w zależności od typu komórek, ale zazwyczaj komórki są zbierane i wirowane w celu uzyskania osadu bogatego w komórki. Osad ten następnie ponownie zawiesza się w supernatancie zmieszanym ze środkiem krioprotekcyjnym lub pożywką do kriokonserwacji.

Medium do kriokonserwacji

Pożywkę tę stosuje się do konserwacji komórek w środowiskach o niskiej temperaturze, na jakie będą narażone, poprzez hamowanie tworzenia kryształów wewnątrz i zewnątrzkomórkowych, a tym samym śmierci komórek. Ich rolą jest zapewnienie bezpiecznego, ochronnego środowiska dla komórek i tkanek podczas procesów zamrażania, przechowywania i rozmrażania.

Pożywkę taką jak świeżo mrożone osocze (FFP), heparynizowany roztwór plazmalitu lub roztwory wolne od surowicy i składników zwierzęcych miesza się z krioprotektantami, takimi jak sulfotlenek dimetylu (DMSO) lub glicerol.

Ponownie upłynniony osad próbki dzieli się na porcje do polipropylenowych kriofiolek, npFirma biomedyczna Suzhou Ace Fiolki do przechowywania kriogenicznego.

Ważne jest, aby nie przepełniać kriofiolek, ponieważ zwiększa to ryzyko pęknięcia i możliwego uwolnienia zawartości (1).

Kontrolowana szybkość zamrażania

Ogólnie rzecz biorąc, w celu skutecznej kriokonserwacji komórek stosuje się powolne, kontrolowane tempo zamrażania.

Po podzieleniu próbek do fiolek kriogenicznych umieszcza się je na mokrym lodzie lub w lodówce o temperaturze 4°C i w ciągu 5 minut rozpoczyna się procedurę zamrażania. Ogólnie rzecz biorąc, ogniwa są schładzane z szybkością od -1 do -3 na minutę (2). Osiąga się to za pomocą programowalnej lodówki lub poprzez umieszczenie fiolek w izolowanym pudełku umieszczonym w zamrażarce z kontrolowaną szybkością od –70°C do –90°C.

Przejście na ciekły azot

Zamrożone fiolki kriogeniczne są następnie przenoszone do zbiornika z ciekłym azotem na czas nieokreślony, pod warunkiem utrzymania temperatury poniżej -135°C.

Te ultraniskie temperatury można uzyskać poprzez zanurzenie w azocie w fazie ciekłej lub gazowej.

Faza ciekła czy gazowa?

Wiadomo, że przechowywanie w azocie w fazie ciekłej pozwala na utrzymanie zimnej temperatury o absolutnej konsystencji, ale często nie jest zalecane z następujących powodów:

• Konieczność stosowania dużych ilości (głębokości) ciekłego azotu, co stanowi potencjalne zagrożenie. Oparzenia lub uduszenie z tego powodu stanowią realne ryzyko.
• Udokumentowane przypadki zanieczyszczenia krzyżowego czynnikami zakaźnymi, takimi jak aspergillus, hep B i wirusem rozprzestrzeniającym się poprzez środowisko ciekłego azotu (2,3)
• Możliwość przedostania się ciekłego azotu do fiolek podczas zanurzenia. Po wyjęciu z magazynu i ogrzaniu do temperatury pokojowej azot gwałtownie się rozszerza. W związku z tym fiolka może rozbić się po wyjęciu z magazynu ciekłego azotu, stwarzając zagrożenie zarówno ze strony latających odłamków, jak i narażenia na zawartość (1, 4).

Z tych powodów przechowywanie w bardzo niskich temperaturach odbywa się najczęściej w atmosferze azotu w fazie gazowej. Jeżeli próbki muszą być przechowywane w fazie ciekłej, należy zastosować specjalistyczne rurki krioflex.

Wadą fazy gazowej jest to, że może wystąpić pionowy gradient temperatury, powodujący wahania temperatury w zakresie od -135 ℃ do -190 ℃. Wymaga to uważnego i sumiennego monitorowania poziomów ciekłego azotu i zmian temperatury (5).

Wielu producentów zaleca, aby kriofiolki nadawały się do przechowywania w temperaturze do -135°C lub do stosowania wyłącznie w fazie gazowej.

Rozmrażanie kriokonserwowanych komórek

Procedura rozmrażania jest stresująca dla zamrożonej kultury i wymagane jest odpowiednie postępowanie i technika, aby zapewnić optymalną żywotność, regenerację i funkcjonalność komórek. Dokładne protokoły rozmrażania będą zależeć od konkretnych typów komórek. Jednakże szybkie rozmrażanie jest uważane za standardowe w celu:

• Zmniejsz wpływ na regenerację komórek
• Pomóż skrócić czas ekspozycji na substancje rozpuszczone obecne w mediach zamrażających
• Zminimalizuj wszelkie uszkodzenia spowodowane rekrystalizacją lodu

Do rozmrażania próbek powszechnie stosuje się łaźnie wodne, kąpiele kulkowe lub specjalistyczne, automatyczne instrumenty.

Najczęściej 1 linię komórkową rozmraża się przez 1-2 minuty, delikatnie mieszając w łaźni wodnej o temperaturze 37 ℃, aż w fiolce pozostanie tylko niewielka cząstka lodu, a następnie przemywa się je we wstępnie ogrzanej pożywce wzrostowej.

W przypadku niektórych komórek, takich jak embriony ssaków, powolne ogrzewanie jest niezbędne do ich przetrwania.

Komórki są teraz gotowe do hodowli komórkowej, izolacji komórek lub, w przypadku hematopoetycznych komórek macierzystych, do badań żywotności w celu zagwarantowania integralności komórek macierzystych dawcy przed terapią mieloablacyjną.

Normalną praktyką jest pobieranie małych porcji wstępnie przemytej próbki wykorzystywanej do zliczania komórek w celu określenia stężeń komórek do wysiania w hodowli. Następnie można ocenić wyniki procedur izolacji komórek i określić ich żywotność.

Najlepsze praktyki przechowywania kriofiolek

Skuteczna kriokonserwacja próbek przechowywanych w kriofiolkach zależy od wielu elementów protokołu, w tym od prawidłowego przechowywania i prowadzenia dokumentacji.

• Podziel komórki pomiędzy lokalizacjami przechowywania– Jeśli pozwala na to objętość, należy podzielić komórki pomiędzy fiolki i przechowywać je w oddzielnych miejscach, aby zmniejszyć ryzyko utraty próbki z powodu awarii sprzętu.
• Zapobiegaj zanieczyszczeniu krzyżowemu– Przed kolejnym użyciem wybierz jednorazowe sterylne fiolki kriogeniczne lub autoklaw
• Używaj fiolek o odpowiedniej wielkości dla swoich komórek– fiolki są dostępne w zakresie objętości od 1 do 5 ml. Unikaj przepełniania fiolek, aby zmniejszyć ryzyko pękania.
• Wybierz fiolki kriogeniczne z gwintem wewnętrznym lub zewnętrznym– Fiolki z gwintem wewnętrznym są zalecane przez niektóre uniwersytety ze względów bezpieczeństwa – mogą również zapobiegać zanieczyszczeniu podczas napełniania lub przechowywania w ciekłym azocie.
• Zapobiegaj wyciekom- Należy używać uszczelek podwójnie wtryskiwanych w zakrętce lub pierścieniach typu O-ring, aby zapobiec wyciekom i zanieczyszczeniom.
• Używaj kodów kreskowych 2D i etykietuj fiolki– aby zapewnić identyfikowalność, fiolki z dużymi powierzchniami do opisu umożliwiają odpowiednie oznakowanie każdej fiolki. Kody kreskowe 2D mogą pomóc w zarządzaniu magazynowaniem i prowadzeniu dokumentacji. Oznaczone kolorami czapki są przydatne w celu łatwiejszej identyfikacji.
• Odpowiednia konserwacja magazynu- Aby mieć pewność, że komórki nie zostaną utracone, zbiorniki magazynujące powinny stale monitorować temperaturę i poziom ciekłego azotu. Należy zainstalować alarmy ostrzegające użytkowników o błędach.

Środki ostrożności

Ciekły azot stał się powszechną praktyką we współczesnych badaniach, ale niesie ze sobą ryzyko poważnych obrażeń w przypadku nieprawidłowego użycia.

Należy nosić odpowiedni sprzęt ochrony osobistej (PPE), aby zminimalizować ryzyko odmrożeń, oparzeń i innych niepożądanych zdarzeń podczas obchodzenia się z ciekłym azotem. Nosić

• Rękawiczki kriogeniczne
• Fartuch laboratoryjny
• Odporna na uderzenia pełna osłona twarzy, która zakrywa również szyję
• Buty z zakrytymi palcami
• Fartuch z tworzywa sztucznego odporny na zachlapania

Lodówki z ciekłym azotem należy umieszczać w dobrze wentylowanych pomieszczeniach, aby zminimalizować ryzyko uduszenia – wydostający się azot odparowuje i wypiera tlen atmosferyczny. Wielkogabarytowe sklepy powinny mieć systemy alarmowe o niskim poziomie tlenu.

Idealna jest praca w parach przy obchodzeniu się z ciekłym azotem, a jego używanie poza normalnymi godzinami pracy powinno być zabronione.

Cryovials wspierające Twój przepływ pracy

Firma Suzhou Ace Biomedical oferuje szeroki wybór produktów spełniających Twoje potrzeby w zakresie kriokonserwacji różnych typów komórek. Oferta obejmuje szeroką gamę probówek, a także gamę sterylnych kriofiolek.

Nasze kriofiolki to:

• Zakrętka laboratoryjna 0,5 ml 1,5 ml 2,0 ml fiolki kriogeniczne fiolki kriogeniczne Stożkowa dolna krioprobówka z uszczelką

  ● Specyfikacja 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml, z osłoną lub bez osłony
  ● Dostępne są modele stożkowe lub wolnostojące, sterylne lub niesterylne
  ● Rurki z zakrętką wykonane są z polipropylenu klasy medycznej
  ● Fiolki z krioprobówkami PP można wielokrotnie zamrażać i rozmrażać
  ● Konstrukcja zewnętrznej nasadki może zmniejszyć prawdopodobieństwo zanieczyszczenia podczas obróbki próbki.
  ● Probówki kriogeniczne z zakrętką. Uniwersalne gwinty do użytku
  ● Rurki pasują do większości popularnych rotorów
  ● Rurki kriogeniczne z pierścieniami uszczelniającymi pasują do standardowych zamrażarek 1-calowych i 2-calowych, 48-dołkowych, 81-dołkowych, 96-dołkowych i 100-dołkowych
  ● Można sterylizować w autoklawie w temperaturze 121°C i zamrażać do -86°C

  NR CZĘŚCI	TWORZYWO	TOM	CZAPKAKOLOR	szt./TORBA	TORBY/TORBY
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Czarny, żółty, niebieski, czerwony, fioletowy, biały	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Czarny, żółty, niebieski, czerwony, fioletowy, biały	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Czarny, żółty, niebieski, czerwony, fioletowy, biały	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Czarny, żółty, niebieski, czerwony, fioletowy, biały	500	10