Standaryzacja procesów obejmuje ich optymalizację, a następnie ustalenie i harmonizację, pozwalającą na długoterminową optymalną realizację – niezależnie od użytkownika. Standaryzacja zapewnia wysoką jakość wyników, ich powtarzalność i porównywalność.
Celem (klasycznej) PCR jest uzyskanie wiarygodnego i powtarzalnego wyniku. W przypadku niektórych zastosowań wydajnośćProdukt PCRjest również istotne. W przypadku tych reakcji należy zadbać o to, aby próbki nie zostały naruszone i aby przebieg reakcji PCR pozostał stabilny. W szczególności przekłada się to na minimalizację wprowadzania zanieczyszczeń, które mogłyby prowadzić do fałszywie dodatnich lub fałszywie ujemnych wyników, a nawet hamować reakcję PCR. Ponadto warunki reakcji powinny być jak najbardziej identyczne dla każdej próbki w ramach serii i można je również przenieść na kolejne reakcje (tą samą metodą). Odnosi się to do składu reakcji, jak również do rodzaju kontroli temperatury w cyklerze. Oczywiście należy w miarę możliwości unikać błędów użytkownika.
Poniżej zademonstrujemy wyzwania napotykane podczas przygotowania i całego przebiegu reakcji PCR, a także istniejące podejścia do rozwiązań w odniesieniu do instrumentów i materiałów eksploatacyjnych używanych do standaryzacji przebiegu reakcji PCR.
Przygotowanie reakcji
Dozowanie składników reakcji do odpowiednio naczyń do PCR lub płytek wiąże się z wieloma wyzwaniami, którym należy stawić czoła:
Warunki reakcji
Dokładne i precyzyjne dozowanie poszczególnych składników jest niezbędne, jeśli chcemy uzyskać jak najbardziej identyczne warunki reakcji. Oprócz dobrej techniki pipetowania decydujące znaczenie ma wybór odpowiedniego narzędzia. Mastermiksy PCR często zawierają substancje zwiększające lepkość lub tworzące pianę. Podczas procesu pipetowania prowadzą one do znacznego zwilżenia cieczykońcówki do pipetzmniejszając w ten sposób dokładność pipetowania. Stosowanie systemów bezpośredniego dozowania lub alternatywnych końcówek do pipet, które są mniej podatne na zwilżanie, może poprawić dokładność i precyzję procesu pipetowania.
Zanieczyszczenia
Podczas procesu dozowania powstają aerozole, które, jeśli dostaną się do wnętrza pipety, mogą potencjalnie skazić inną próbkę podczas następnego etapu pipetowania. Można temu zapobiec stosując końcówki z filtrem lub systemy bezpośredniego wyporu.
Materiały eksploatacyjne takie jakporadynaczynia i płytki używane w procesie PCR nie mogą zawierać substancji, które pogarszają jakość próbki lub fałszują wynik. Należą do nich DNA, DNazy, RNazy i inhibitory PCR, a także składniki, które mogą potencjalnie wymyć się z materiału podczas reakcji – substancje zwane substancjami wymywalnymi.
Błąd użytkownika
Im więcej próbek jest przetwarzanych, tym większe ryzyko błędu. Może się łatwo zdarzyć, że próbka zostanie przepipetowana do niewłaściwego naczynia lub niewłaściwej studzienki. Ryzyko to można znacznie zmniejszyć poprzez łatwe do rozpoznania oznakowanie odwiertów. Dzięki automatyzacji etapów dozowania minimalizowany jest „czynnik ludzki”, tj. błędy i różnice związane z użytkownikiem, zwiększając w ten sposób powtarzalność, szczególnie w przypadku małych objętości reakcji. Wymaga to zastosowania na stanowisku pracy płyt o wystarczającej stabilności wymiarowej. Dołączone kody kreskowe zapewniają dodatkową czytelność maszynową, co upraszcza śledzenie próbek w całym procesie.
Programowanie termocyklera
Programowanie przyrządu może okazać się czasochłonne i podatne na błędy. Różne funkcje termocyklera PCR współpracują ze sobą, aby uprościć ten etap procesu i, co najważniejsze, zapewnić jego bezpieczeństwo:
Łatwa obsługa i dobre wskazówki dla użytkownika są podstawą wydajnego programowania. Opierając się na tym fundamencie, administracja użytkownikami chroniona hasłem zapobiegnie modyfikowaniu własnych programów przez innych użytkowników. Jeśli używanych jest wiele cyklerów (tego samego typu), korzystne jest, aby program można było przenieść bezpośrednio z jednego instrumentu na drugi za pośrednictwem USB lub połączenia. Oprogramowanie komputerowe umożliwia centralne i bezpieczne administrowanie programami, uprawnieniami użytkowników i dokumentami znajdującymi się na komputerze.
Przebieg PCR
Podczas cyklu DNA ulega amplifikacji w naczyniu reakcyjnym, gdzie każdą próbkę należy poddać identycznym, stałym warunkom reakcji. Dla procesu istotne są następujące aspekty:
Kontrola temperatury
Doskonała dokładność kontroli temperatury i jednorodność bloku cyklera są podstawą równomiernego kondycjonowania temperaturowego wszystkich próbek. Wysoka jakość elementów grzejnych i chłodzących (elementy Peltiera) oraz sposób ich podłączenia do bloku to czynniki decydujące o ryzyku wystąpienia rozbieżności temperatur, tzw. „efektu krawędziowego”.
Odparowanie
Stężenia poszczególnych składników reakcji nie powinny zmieniać się w trakcie reakcji ze względu na parowanie. W przeciwnym razie możliwe jest, że bardzo niewieleProdukt PCRmogą zostać wygenerowane lub wcale. Dlatego niezwykle istotne jest zminimalizowanie parowania poprzez zapewnienie bezpiecznego uszczelnienia. W tym przypadku podgrzewana pokrywa termocyklera i uszczelka naczynia współpracują ze sobą. Dostępne są różne opcje uszczelnieniaPłytki do PCR (link: artykuł dotyczący uszczelniania), przy czym najlepsze uszczelnienie uzyskuje się poprzez zgrzewanie. Odpowiednie mogą być także inne zamknięcia, pod warunkiem, że docisk pokrywy cyklera można dostosować do wybranego uszczelnienia.
Wprowadzono standaryzację procesów, aby zapewnić dokładne i powtarzalne wyniki w dłuższej perspektywie. Obejmuje to regularną konserwację sprzętu, aby mieć pewność, że jest on zawsze w dobrym stanie. Wszystkie materiały eksploatacyjne powinny charakteryzować się niezmiennie wysoką jakością we wszystkich produkowanych partiach i należy zagwarantować ich niezawodną dostępność.
Czas publikacji: 29 listopada 2022 r