ਸਾਨੂੰ ਮੇਰੀ ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ ਵਿੱਚ ਕਿੰਨਾ ਟੈਂਪਲੇਟ ਜੋੜਨਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ?

ਭਾਵੇਂ ਸਿਧਾਂਤਕ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਟੈਂਪਲੇਟ ਦਾ ਇੱਕ ਅਣੂ ਕਾਫੀ ਹੋਵੇਗਾ, ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ ਕਲਾਸਿਕ ਪੀਸੀਆਰ ਲਈ ਡੀਐਨਏ ਦੀ ਕਾਫ਼ੀ ਵੱਡੀ ਮਾਤਰਾ ਵਰਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ, ਜੀਨੋਮਿਕ ਥਣਧਾਰੀ ਡੀਐਨਏ ਦੇ 1 µg ਤੱਕ ਅਤੇ ਪਲਾਜ਼ਮੀਡ ਡੀਐਨਏ ਦੇ 1 pg ਤੋਂ ਘੱਟ। ਅਨੁਕੂਲ ਮਾਤਰਾ ਟੀਚੇ ਦੇ ਕ੍ਰਮ ਦੀਆਂ ਕਾਪੀਆਂ ਦੀ ਸੰਖਿਆ ਦੇ ਨਾਲ-ਨਾਲ ਇਸਦੀ ਗੁੰਝਲਤਾ 'ਤੇ ਵੀ ਨਿਰਭਰ ਕਰਦੀ ਹੈ।

ਜੇਕਰ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਟੈਂਪਲੇਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਤਾਂ ਉਤਪਾਦ ਦੀ ਲੋੜੀਂਦੀ ਮਾਤਰਾ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਚੱਕਰਾਂ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਵਿੱਚ ਅਨੁਸਾਰੀ ਵਾਧੇ ਦੀ ਲੋੜ ਹੋਵੇਗੀ। ਇੱਕ Taq ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਜੋ ਕਿ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ PCR ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਇੱਕ ਸੁਧਾਰ ਫੰਕਸ਼ਨ (3′-5′ exonuclease ਗਤੀਵਿਧੀ) ਨਹੀਂ ਰੱਖਦਾ; ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ, ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਦੌਰਾਨ ਹੋਣ ਵਾਲੀਆਂ ਗਲਤੀਆਂ ਨੂੰ ਠੀਕ ਨਹੀਂ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ। ਚੱਕਰਾਂ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਜਿੰਨੀ ਜ਼ਿਆਦਾ ਹੋਵੇਗੀ, ਨੁਕਸਦਾਰ ਉਤਪਾਦ ਦਾ ਪ੍ਰਸਾਰ ਓਨਾ ਹੀ ਜ਼ਿਆਦਾ ਪ੍ਰਚਲਿਤ ਹੋਵੇਗਾ। ਜੇ, ਦੂਜੇ ਪਾਸੇ, ਟੈਂਪਲੇਟ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੇ ਦੂਜੇ (ਸੌ ਪ੍ਰਤੀਸ਼ਤ ਪ੍ਰਸ਼ੰਸਾਯੋਗ ਨਹੀਂ) ਕ੍ਰਮਾਂ ਨੂੰ ਐਨੀਲਿੰਗ ਕਰਨ ਦੀ ਸੰਭਾਵਨਾ, ਅਤੇ ਨਾਲ ਹੀ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਾਈਮਰਾਂ ਦੇ ਬਣਨ ਦੀ ਸੰਭਾਵਨਾ ਵਧੇਗੀ, ਜਿਸ ਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਵਿਸਤਾਰ ਵਿੱਚ ਵਾਧਾ ਹੋਵੇਗਾ। ਉਪ-ਉਤਪਾਦ. ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਮਾਮਲਿਆਂ ਵਿੱਚ, ਡੀਐਨਏ ਸੈੱਲ ਸਭਿਆਚਾਰਾਂ ਜਾਂ ਸੂਖਮ ਜੀਵਾਂ ਤੋਂ ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਪੀਸੀਆਰ ਟੈਂਪਲੇਟ ਵਜੋਂ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਪੀਸੀਆਰ ਸੈੱਟਅੱਪ ਲਈ ਲੋੜੀਂਦੀ ਮਾਤਰਾ ਨੂੰ ਪਰਿਭਾਸ਼ਿਤ ਕਰਨ ਦੇ ਯੋਗ ਹੋਣ ਲਈ ਡੀਐਨਏ ਦੀ ਇਕਾਗਰਤਾ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨਾ ਜ਼ਰੂਰੀ ਹੈ। ਹਾਲਾਂਕਿ ਐਗਰੋਜ਼ ਜੈੱਲ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰੇਸਿਸ ਇੱਕ ਅਨੁਮਾਨ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਨ ਲਈ ਕੰਮ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਇਹ ਵਿਧੀ ਸਹੀ ਤੋਂ ਬਹੁਤ ਦੂਰ ਹੈ। ਯੂਵੀ-ਵਿਸ ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਫੋਟੋਮੈਟਰੀ ਨੂੰ ਨਿਊਕਲੀਕ ਐਸਿਡ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਲਈ ਸੋਨੇ ਦੇ ਮਿਆਰ ਵਜੋਂ ਸਥਾਪਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ; ਇਹ ਸਿੱਧੀ ਅਤੇ ਇਸਲਈ ਆਸਾਨ ਅਤੇ ਤੇਜ਼ ਵਿਧੀ 260 nm 'ਤੇ ਨਮੂਨੇ ਦੇ ਸੋਖਣ ਨੂੰ ਮਾਪਦੀ ਹੈ, ਅਤੇ ਇਕਾਗਰਤਾ ਨੂੰ ਪਰਿਵਰਤਨ ਕਾਰਕ ਦੀ ਮਦਦ ਨਾਲ ਗਿਣਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।

ਜੇਕਰ DNA ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਹੈ, ਹਾਲਾਂਕਿ (<1 µg/mL dsDNA), ਜਾਂ ਜੇਕਰ ਇਹ ਉਹਨਾਂ ਪਦਾਰਥਾਂ ਨਾਲ ਦੂਸ਼ਿਤ ਹੈ ਜੋ 260 nm ਰੇਂਜ (ਜਿਵੇਂ ਕਿ RNA, ਪ੍ਰੋਟੀਨ, ਲੂਣ) ਵਿੱਚ ਵੀ ਜਜ਼ਬ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਤਾਂ ਇਹ ਵਿਧੀ ਆਪਣੀਆਂ ਸੀਮਾਵਾਂ ਤੱਕ ਪਹੁੰਚ ਜਾਵੇਗੀ। ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦੇ ਮਾਮਲੇ ਵਿੱਚ, ਰੀਡਿੰਗ ਜਲਦੀ ਹੀ ਵਰਤੋਂ ਲਈ ਬਹੁਤ ਗਲਤ ਹੋ ਜਾਣਗੀਆਂ, ਅਤੇ ਗੰਦਗੀ ਅਸਲ ਮੁੱਲ ਦੇ (ਕਈ ਵਾਰ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ) ਅੰਦਾਜ਼ੇ ਵੱਲ ਲੈ ਜਾਵੇਗੀ। ਇਸ ਸਥਿਤੀ ਵਿੱਚ, ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਮਾਪਣਾ ਇੱਕ ਵਿਕਲਪ ਪੇਸ਼ ਕਰ ਸਕਦੀ ਹੈ। ਇਹ ਤਕਨੀਕ ਇੱਕ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਡਾਈ ਦੀ ਵਰਤੋਂ 'ਤੇ ਅਧਾਰਤ ਹੈ ਜੋ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਤੌਰ 'ਤੇ dsDNA ਨਾਲ ਜੋੜਦਾ ਹੈ ਸਿਰਫ ਨਿਊਕਲੀਕ ਐਸਿਡ ਅਤੇ ਡਾਈ ਵਾਲਾ ਗੁੰਝਲਦਾਰ ਰੋਸ਼ਨੀ ਦੁਆਰਾ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਇਹ ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ ਥੋੜ੍ਹੀ ਉੱਚੀ ਤਰੰਗ-ਲੰਬਾਈ ਦੀ ਰੋਸ਼ਨੀ ਨੂੰ ਛੱਡੇਗਾ। ਇੱਥੇ, ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਸਿਗਨਲ ਦੀ ਤੀਬਰਤਾ ਡੀਐਨਏ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਦੇ ਅਨੁਪਾਤੀ ਹੈ, ਅਤੇ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ ਇਸਦਾ ਇੱਕ ਮਿਆਰੀ ਕਰਵ ਦੇ ਸਬੰਧ ਵਿੱਚ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਇਸ ਵਿਧੀ ਦੇ ਫਾਇਦੇ ਬਾਂਡ ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ 'ਤੇ ਨਿਰਭਰ ਕਰਦੇ ਹਨ, ਜੋ ਗੰਦਗੀ ਦੁਆਰਾ ਪੇਸ਼ ਕੀਤੇ ਗਏ ਬਾਹਰੀ ਪ੍ਰਭਾਵਾਂ ਨੂੰ ਬਾਹਰ ਕੱਢਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਨਾਲ ਹੀ ਡੀਐਨਏ ਦੀ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਦੀ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਯੋਗਤਾ 'ਤੇ ਵੀ ਨਿਰਭਰ ਕਰਦਾ ਹੈ। ਕਿਸੇ ਵੀ ਵਿਧੀ ਦੀ ਅਨੁਕੂਲਤਾ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਨਮੂਨੇ ਦੀ ਇਕਾਗਰਤਾ ਅਤੇ ਸ਼ੁੱਧਤਾ 'ਤੇ ਨਿਰਭਰ ਕਰਦੀ ਹੈ; ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਮਾਮਲਿਆਂ ਵਿੱਚ ਇਹ ਦੋਵੇਂ ਤਰੀਕਿਆਂ ਨੂੰ ਸਮਾਨਾਂਤਰ ਵਿੱਚ ਲਾਗੂ ਕਰਨ ਦੀ ਸਲਾਹ ਵੀ ਦਿੱਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ।