Kryovialerbrukes ofte til kryogen lagring av cellelinjer og andre kritiske biologiske materialer, i dewars fylt med flytende nitrogen.

Det er flere stadier involvert i vellykket bevaring av celler i flytende nitrogen. Selv om det grunnleggende prinsippet er en langsom frysing, avhenger den eksakte teknikken som brukes av celletypen og kryobeskyttelsesmidlet som brukes. Det er flere sikkerhetshensyn og beste praksis å ta i betraktning når celler lagres ved så lave temperaturer.

Dette innlegget har som mål å gi en oversikt over hvordan kryovialer lagres i flytende nitrogen.

Hva er kryovialer

Kryovialer er små hetteglass designet for oppbevaring av væskeprøver ved ekstremt lave temperaturer. De sørger for at celler bevart i kryobeskyttelsesmiddel ikke kommer i direkte kontakt med flytende nitrogen, og minimerer risikoen for cellebrudd mens de fortsatt drar nytte av den ekstreme kjølende effekten av flytende nitrogen.

Hetteglassene er vanligvis tilgjengelige i en rekke volumer og design – de kan være innvendig eller utvendig gjenget med flat eller avrundet bunn. Sterile og ikke-sterile formater er også tilgjengelige.

Hvem brukerCyrovialerå lagre celler i flytende nitrogen

En rekke NHS og private laboratorier, samt forskningsinstitusjoner som spesialiserer seg på navlestrengsblodbank, epitelcellebiologi, immunologi og stamcellebiologi bruker kryovialer for å kryobevare celler.

Celler bevart på denne måten inkluderer B- og T-celler, CHO-celler, hematopoietiske stam- og stamceller, hybridomer, tarmceller, makrofager, mesenkymale stam- og stamceller, monocytter, myelom, NK-celler og pluripotente stamceller.

Oversikt over hvordan du lagrer kryovialer i flytende nitrogen

Kryokonservering er en prosess som bevarer celler og andre biologiske konstruksjoner ved å avkjøle dem til svært lave temperaturer. Celler kan lagres i flytende nitrogen i årevis uten tap av cellelevedyktighet. Dette er en oversikt over prosedyrene som brukes.

Celleforberedelse

Den nøyaktige metoden for å tilberede prøver vil variere avhengig av celletypen, men generelt samles og sentrifugeres cellene for å utvikle en cellerik pellet. Denne pelleten resuspenderes deretter i supernatanten blandet med kryobeskyttelsesmiddel eller et kryokonserveringsmedium.

Kryokonserveringsmedium

Dette mediet brukes for å bevare celler i lavtemperaturmiljøene de vil bli utsatt for ved å hemme dannelsen av intra- og ekstracellulære krystaller og dermed celledød. Deres rolle er å gi et trygt, beskyttende miljø for celler og vev under fryse-, lagrings- og tiningsprosessene.

Et medium som fersk frossen plasma (FFP), heparinisert plasmalyttoppløsning eller serumfrie, dyrekomponentfrie løsninger blandes med kryobeskyttelsesmidler som dimetylsulfoksid (DMSO) eller glyserol.

Den gjenflytende prøvepelleten fordeles i polypropylen-kryovialer som f.eksSuzhou Ace Biomedisinsk selskap Cryogenic Storage Vials.

Det er viktig å ikke overfylle kryovialene da dette vil øke risikoen for sprekker og mulig utslipp av innhold (1).

Kontrollert frysehastighet

Generelt brukes en langsom kontrollert frysehastighet for vellykket kryokonservering av celler.

Etter at prøvene er delt opp i kryogene hetteglass, plasseres de på våt is eller i et 4℃ kjøleskap og fryseprosedyren startes innen 5 minutter. Som en generell veiledning avkjøles cellene med en hastighet på -1 til -3 per minutt (2). Dette oppnås ved å bruke en programmerbar kjøler eller ved å plassere hetteglass i en isolert boks plassert i en –70°C til –90°C kontrollert fryser.

Overfør til flytende nitrogen

De frosne kryogene ampullene overføres deretter til en flytende nitrogentank i ubestemte perioder, forutsatt at en temperatur på mindre enn -135 ℃ opprettholdes.

Disse ultralave temperaturene kan oppnås ved nedsenking i flytende eller dampfase nitrogen.

Væske- eller dampfase?

Lagring i flytende nitrogen er kjent for å opprettholde den kalde temperaturen med absolutt konsistens, men anbefales ofte ikke av følgende grunner:

• Behovet for store volumer (dybde) flytende nitrogen som er en potensiell fare. Brannskader eller kvelning på grunn av dette er en reell risiko.
• Dokumenterte tilfeller av krysskontaminering med smittestoffer som aspergillus, hep B og virusspredning via det flytende nitrogenmediet (2,3)
• Muligheten for at flytende nitrogen lekker inn i hetteglassene under nedsenking. Når det fjernes fra lagring og varmes opp til romtemperatur, utvider nitrogenet seg raskt. Følgelig kan hetteglasset knuses når det fjernes fra lagring av flytende nitrogen, noe som skaper en fare fra både flygende rusk og eksponering for innholdet (1, 4).

Av disse grunner er lagring med ultralav temperatur oftest i dampfase nitrogen. Når prøver må oppbevares i væskefasen, bør spesialiserte cryoflex-slange brukes.

Ulempen med dampfasen er at en vertikal temperaturgradient kan oppstå som resulterer i temperatursvingninger mellom -135 ℃ og -190 ℃. Dette nødvendiggjør nøye og grundig overvåking av nivåene av flytende nitrogen og temperaturvariasjoner (5).

Mange produsenter anbefaler at kryovialer er egnet for lagring ned til -135 ℃ eller kun for bruk i dampfasen.

Tining av kryokonserverte celler

Tineprosedyren er stressende for en frossen kultur, og riktig håndtering og teknikk er nødvendig for å sikre optimal levedyktighet, utvinning og funksjonalitet til cellene. De nøyaktige tineprotokollene vil avhenge av spesifikke celletyper. Imidlertid anses rask tining som standard for:

• Reduser enhver innvirkning på cellulær utvinning
• Bidra til å redusere eksponeringstiden for de oppløste stoffene i frysemediet
• Minimer skade ved is-rekrystallisering

Vannbad, perlebad eller spesialiserte automatiserte instrumenter brukes ofte til å tine prøver.

Oftest tines 1 cellelinje om gangen i 1-2 minutter ved å virvle forsiktig i et 37℃ vannbad til det bare er en liten bit is igjen i hetteglasset før de vaskes i et forvarmet vekstmedium.

For noen celler som pattedyrembryoer er langsom oppvarming avgjørende for deres overlevelse.

Cellene er nå klare for cellekultur, celleisolering, eller i tilfelle av hematopoietiske stamceller - levedyktighetsstudier for å garantere integriteten til donorstamcellene før myeloablativ terapi.

Det er vanlig praksis å ta små porsjoner av den forhåndsvaskede prøven som brukes til å utføre en celletelling for å bestemme cellekonsentrasjoner for utplating i kultur. Du kan deretter vurdere resultatene av celleisolasjonsprosedyrer og bestemme cellelevedyktighet.

Beste praksis for lagring av kryovialer

Vellykket kryokonservering av prøver lagret i kryovialer avhenger av mange elementer i protokollen, inkludert riktig lagring og journalføring.

• Del celler mellom lagringssteder– Hvis volumene tillater det, del celler mellom hetteglass og oppbevar dem på separate steder for å redusere risikoen for prøvetap på grunn av utstyrsfeil.
• Forhindre krysskontaminering– Velg sterile kryogene hetteglass for engangsbruk eller autoklav før påfølgende bruk
• Bruk hetteglass med passende størrelse for cellene dine– hetteglass kommer i en rekke volumer mellom 1 og 5 ml. Unngå overfylling av hetteglass for å redusere risikoen for sprekker.
• Velg innvendige eller eksternt gjengede kryogene hetteglass– Innvendig gjengede hetteglass anbefales av noen universiteter for sikkerhetstiltak – de kan også forhindre forurensning under fylling eller når de lagres i flytende nitrogen.
• Forhindre lekkasje- Bruk bi-injiserte tetninger støpt inn i skrulokket eller O-ringene for å forhindre lekkasje og forurensning.
• Bruk 2D strekkoder og merke hetteglass– For å sikre sporbarhet gjør hetteglass med store skriveflater det mulig å merke hvert hetteglass tilstrekkelig. 2D-strekkoder kan hjelpe med lagringsadministrasjon og journalføring. Fargekodede hetter er nyttige for enklere identifikasjon.
• Tilstrekkelig vedlikehold av lagring- For å sikre at cellene ikke går tapt, bør lagerbeholdere konstant overvåke temperaturen og nivået av flytende nitrogen. Alarmer bør monteres for å varsle brukere om feil.

Sikkerhetsregler

Flytende nitrogen har blitt vanlig praksis i moderne forskning, men medfører risiko for alvorlige skader hvis det brukes feil.

Riktig personlig verneutstyr (PPE) bør brukes for å minimere risikoen for frostskader, brannskader og andre uønskede hendelser ved håndtering av flytende nitrogen. Slitasje

• Kryogene hansker
• Laboratoriefrakk
• Slagfast helansiktsskjerm som også dekker nakken
• Sko med lukkede tå
• Sprutsikkert plastforkle

Kjøleskap med flytende nitrogen bør plasseres i godt ventilerte områder for å minimere risikoen for kvelning – rømt nitrogen fordamper og fortrenger atmosfærisk oksygen. Store volumlagre bør ha lavoksygenalarmsystemer.

Arbeid i par ved håndtering av flytende nitrogen er ideelt og bruk utenom normal arbeidstid bør være forbudt.

Kryovialer for å støtte arbeidsflyten din

Suzhou Ace Biomedical-selskapet tilbyr et bredt utvalg av produkter som oppfyller dine kryokonserveringsbehov for forskjellige typer celler. Porteføljen inkluderer en rekke rør så vel som en rekke sterile kryovialer.

Kryovialene våre er:

• Lab skrukork 0,5 mL 1,5 mL 2,0 mL kryoviale kryogene hetteglass konisk bunn kryorør med pakning

  ● 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml spesifikasjon, med skjørt eller uten skjørt
  ● Konisk eller selvstående design, steril eller ikke-steril er begge tilgjengelige
  ● Skrulokkrør er laget av polypropylen av medisinsk kvalitet
  ● PP Cryotube hetteglass kan fryses og tines gjentatte ganger
  ●Den eksterne hettens design kan redusere forurensningssannsynligheten under prøvebehandling.
  ● Kryogenrør med skrulokk Universalskruegjenger for bruk
  ● Rør passer til de fleste vanlige rotorer
  ● O-ringrør med kryogene rør passer til standard 1-tommers og 2-tommers, 48-brønns, 81-brønns, 96-brønns og 100-brønns frysebokser
  ● Autoklaverbar til 121°C og frysbar til -86°C

  DELENR	MATERIALE	VOLUM	LOKKFARGE	PCS/BAG	VESKER/Etuier
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Svart, gul, blå, rød, lilla, hvit	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Svart, gul, blå, rød, lilla, hvit	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Svart, gul, blå, rød, lilla, hvit	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Svart, gul, blå, rød, lilla, hvit	500	10