Kryovialerbrukes ofte til kryogen lagring av cellelinjer og andre kritiske biologiske materialer, i dugg fylt med flytende nitrogen.

Det er flere stadier involvert i vellykket bevaring av celler i flytende nitrogen. Selv om det grunnleggende prinsippet er en langsom fryse, avhenger den nøyaktige teknikken som brukes av celletypen og kryoprotectant som brukes. Det er flere sikkerhetshensyn og beste praksis å ta hensyn til når du lagrer celler ved så lave temperaturer.

Dette innlegget har som mål å gi en oversikt over hvordan kryovialer lagres i flytende nitrogen.

Hva er kryovialer

Kryovialer er små, avkortede hetteglass designet for lagring av flytende prøver ved ekstremt lave temperaturer. De sikrer at celler som er bevart i kryoprotectant ikke kommer i direkte kontakt med flytende nitrogen, og minimerer risikoen for cellulære brudd, mens de fremdeles drar fordel av den ekstreme kjøleeffekten av flytende nitrogen.

Hetteglassene er vanligvis tilgjengelige i en rekke volumer og design - de kan være internt eller eksternt gjenget med flate eller avrundede bunner. Sterile og ikke-sterile formater er også tilgjengelige.

Som brukerCyrovialså lagre celler i flytende nitrogen

En rekke NHS og private laboratorier, samt forskningsinstitusjoner som spesialiserer seg på ledningsblodbank, epitelcellebiologi, immunologi og stamcellebiologi bruker kryovialer til kryokonserverceller.

Celler som er bevart på denne måten inkluderer B- og T -celler, CHO -celler, hematopoietiske stam- og stamceller, hybridomer, tarmceller, makrofager, mesenkymale stam- og stamceller, monocytter, myelom, NK -celler og pluripotente stamceller.

Oversikt over hvordan du lagrer kryovialer i flytende nitrogen

Kryopreservering er en prosess som bevarer celler og andre biologiske konstruksjoner ved å avkjøle dem til veldig lave temperaturer. Celler kan lagres i flytende nitrogen i årevis uten tap av cellelevedyktighet. Dette er en oversikt over prosedyrene som er brukt.

Celleforberedelse

Den nøyaktige metoden for å fremstille prøver vil variere avhengig av celletypen, men generelt blir cellene samlet og sentrifugert for å utvikle en cellrik pellet. Denne pelleten blir deretter resuspendert i supernatanten blandet med kryoprotectant eller et kryokonserveringsmedium.

Kryokonserveringsmedium

Dette mediet brukes for å bevare celler i miljøene med lav temperatur de vil bli utsatt for ved å hemme dannelsen av intra og ekstracellulære krystaller og derav celledød. Deres rolle er å gi et trygt, beskyttende miljø for celler og vev under frysing, lagring og tine prosesser.

Et medium som fersk frosset plasma (FFP), heparinisert plasmalyuttoppløsning eller serumfri, dyrekomponentfrie løsninger blandes med kryoprotektanter som dimetylsulfoksyd (DMSO) eller glyserol.

Den re-liquifiserte prøvepelleten er alikvotert til polypropylen kryovialer som for eksempelSuzhou Ace Biomedical Company Cryogenic Storage Vals.

Det er viktig å ikke overfylte kryovialene, da dette vil øke risikoen for sprekker og mulig frigjøring av innhold (1).

Kontrollert fryshastighet

Generelt brukes en langsom kontrollert frysehastighet for vellykket kryokonservering av celler.

Etter at prøver er alikjert til kryogene hetteglass, plasseres de på våt is eller i en 4 ℃ kjøleskap og frysingsprosedyren startes i løpet av 5 minutter. Som en generell guide avkjøles celler med en hastighet på -1 til -3 per minutt (2). Dette oppnås ved bruk av en programmerbar kjøler eller ved å plassere hetteglass i en isolert boks plassert i en –70 ° C til –90 ° C kontrollert hastighetsfryser.

Overfør til flytende nitrogen

De frosne kryogene hetteglassene blir deretter overført til en flytende nitrogentank i ubestemte perioder, forutsatt at en temperatur på mindre enn -135 ℃ opprettholdes.

Disse ultra-lave temperaturene kan oppnås ved nedsenking i væske- eller dampfasen nitrogen.

Væske- eller dampfase?

Lagring i flytende fase nitrogen er kjent for å opprettholde den kalde temperaturen med absolutt konsistens, men anbefales ofte ikke av følgende grunner:

• Behovet for store volumer (dybde) av flytende nitrogen som er en potensiell fare. Forbrenning eller kvelning på grunn av dette er en reell risiko.
• Dokumenterte tilfeller av kryssforurensning av smittsomme midler som Aspergillus, Hep B og viral spredning via væsken nitrogenmedium (2,3)
• Potensialet for flytende nitrogen til å lekke inn i hetteglassene under nedsenking. Når den fjernes fra lagring og varmet til romtemperatur, utvides nitrogenet raskt. Følgelig kan hetteglasset knuse når det fjernes fra flytende nitrogenlagring, og skaper en fare fra både flygende rusk og eksponering for innholdet (1, 4).

Av disse grunner er ultra-lav temperaturlagring oftest i dampfasen nitrogen. Når prøver må lagres i væskefasen, bør spesialisert kryofleksrør brukes.

Ulempen med dampfasen er at en vertikal temperaturgradient kan oppstå, noe som resulterer i temperatursvingninger mellom -135 ℃ og -190 ℃. Dette nødvendiggjør nøye og flittig overvåking av flytende nitrogennivåer og temperaturvariasjoner (5).

Mange produsenter anbefaler at kryovialer er egnet for lagring ned til -135 ℃ eller bare for bruk i dampfasen.

Tine kryokonserverte celler

Tiningsprosedyren er stressende for en frossen kultur, og riktig håndtering og teknikk er nødvendig for å sikre optimal levedyktighet, utvinning og funksjonalitet til cellene. De nøyaktige tiningsprotokollene vil avhenge av spesifikke celletyper. Rask tining anses imidlertid som standard for:

• Reduser enhver innvirkning på cellulær utvinning
• Bidra til å redusere eksponeringstiden for de tilstedeværende stoffene i frysemediene
• Minimer eventuell skade ved isrrystallisering

Vannbad, perlebad eller spesialiserte automatiserte instrumenter brukes ofte til å tine prøver.

Oftest er 1 cellelinje tint om gangen i 1-2 minutter, ved å virvle forsiktig inn i et 37 ℃ vannbad til det bare er en liten is igjen i hetteglasset før de vaskes i et vekstmedium.

For noen celler som pattedyrembryoer er langsom oppvarming viktig for å overleve.

Cellene er nå klare for cellekultur, celleisolering eller i tilfelle av hematopoietiske stamceller - levedyktighetsstudier for å garantere integriteten til donorstamcellene før myeloablativ terapi.

Det er normal praksis å ta små alikvoter av den forhåndsvaskede prøven som brukes til å utføre en celletelling for å bestemme cellekonsentrasjoner for plating i kultur. Du kan deretter vurdere resultatene av celleisolasjonsprosedyrer og bestemme cellens levedyktighet.

Beste praksis for lagring av kryovialer

Den vellykkede kryokonserveringen av prøver som er lagret i kryovialer, avhenger av mange elementer i protokollen, inkludert riktig lagring og journalføring.

• Delte celler mellom lagringssteder- Hvis volumene tillater det, splitt celler mellom hetteglass og lagrer dem på separate steder for å redusere risikoen for tap av prøvetap på grunn av utstyrssvikt.
• Forhindre kryssforurensning-Velg engangs sterile kryogene hetteglass eller autoklav før etterfølgende bruk
• Bruk hetteglass med passende størrelse for cellene dine- Hetteglass kommer i en rekke volumer mellom 1 og 5 ml. Unngå overfylling av hetteglass for å redusere risikoen for sprekker.
• Velg interne eller eksternt gjengede kryogene hetteglass- Internt gjengede hetteglass anbefales av noen universiteter for sikkerhetstiltak - de kan også forhindre forurensning under fylling eller når de er lagret i flytende nitrogen.
• Forhindre lekkasje-Bruk bi-injiserte tetninger støpt inn i skruekappen eller O-ringene for å forhindre lekkasje og forurensning.
• Bruk 2D strekkoder og etikett hetteglass- For å sikre sporbarhet, gjør hetteglass med store skriveområder i stand til å være tilstrekkelig merket. 2D strekkoder kan hjelpe med lagringsadministrasjon og rekordstilling. Fargekodede luer er nyttige for enklere identifikasjon.
• Tilstrekkelig lagringsvedlikehold- For å sikre at celler ikke går tapt, bør lagringskar kontinuerlig overvåke temperaturen og flytende nitrogennivået. Alarmer skal monteres for å varsle brukere av feil.

Sikkerhetsforholdsregler

Flytende nitrogen har blitt vanlig praksis innen moderne forskning, men bærer risikoen for alvorlig skade hvis den brukes feil.

Riktig personlig verneutstyr (PPE) bør brukes for å minimere risikoen for frostskader, brannskader og andre ugunstige hendelser når du håndterer flytende nitrogen. Slitasje

• Kryogene hansker
• Laboratoriefrakk
• Effektmotstandsdyktig Full Face Shield som også dekker nakken
• Lukkede tåsko
• Splashproof plastforkle

Flytende nitrogenkjøleskap skal plasseres i godt ventilerte områder for å minimere risikoen for kvelning-slapp unna nitrogen fordamper og fortrenger atmosfærisk oksygen. Store volumbutikker skal ha lave oksygenalarmanlegg.

Å jobbe parvis når du håndterer flytende nitrogen er ideelt og bruken utenfor normal arbeidstid bør være forbudt.

Cryovials for å støtte arbeidsflyten din

Suzhou Ace Biomedical Company tilbyr et bredt utvalg av produkter som oppfyller dine kryokonserveringsbehov for forskjellige typer celler. Porteføljen inkluderer en rekke rør, vel som en rekke sterile kryovialer.

Kryovialene våre er:

• Lab skrue hette 0,5 ml 1,5 ml 2,0 ml kryoviale kryogene hetteglass konisk bunn kryotube med pakning

  ● 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml spesifikasjon, med skjørt eller uten skjørt
  ● Konisk eller selvstående design, steril eller ikke-steril er begge tilgjengelige
  ● Skruehetter er laget av medisinsk kvalitet polypropylen
  ● PP Cryotube hetteglass kan gjentatte ganger frosses og tines
  ● Den eksterne cap -utformingen kan redusere forurensningssannsynligheten under prøvebehandling.
  ● Skrue hette kryogene rør universelle skruetråder for bruk
  ● Rør passer til vanligste rotorer
  ● Kryogene rør O-ringrør passer til standard 1-tommers og 2-tommer
  ● Autoklaverbar til 121 ° C og frysbar til -86 ° C

  Del nr	MATERIALE	VOLUM	LOKKFARGE	PCS/BAG	Vesker/etui
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Svart, gul, blå, rød, lilla, hvit	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Svart, gul, blå, rød, lilla, hvit	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Svart, gul, blå, rød, lilla, hvit	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Svart, gul, blå, rød, lilla, hvit	500	10