Standardiseringen av prosesser inkluderer deres optimering og påfølgende etablering og harmonisering, noe som tillater langsiktig optimal ytelse – uavhengig av brukeren. Standardisering sikrer resultater av høy kvalitet, samt deres reproduserbarhet og sammenlignbarhet.
Målet med (klassisk) PCR er å generere et pålitelig og reproduserbart resultat. For visse bruksområder vil utbyttet avPCR-produkter også relevant. For disse reaksjonene må man sørge for at prøvene ikke kompromitteres og at PCR-arbeidsflyten forblir stabil. Spesielt betyr dette å minimere introduksjonen av forurensninger som kan føre til falske positive eller falske negative resultater eller til og med hemme PCR-reaksjonen. Videre bør reaksjonsbetingelsene være så identiske som mulig for hver enkelt prøve i en kjøring og også kunne overføres til etterfølgende reaksjoner (av samme metode). Dette refererer til sammensetningen av reaksjonene så vel som til typen temperaturkontroll i sykluseren. Brukerfeil skal selvfølgelig unngås så mye som mulig.
Nedenfor vil vi demonstrere utfordringene som oppstår under forberedelse og gjennom kjøringen av en PCR – og tilnærmingene til løsninger som finnes med hensyn til instrumenter og forbruksvarer som brukes for standardisering av PCR-arbeidsflytene.
Reaksjonsforberedelse
Dispensering av reaksjonskomponenter i henholdsvis PCR-kar eller plater omfatter flere utfordringer som må overvinnes:
Reaksjonsforhold
Den nøyaktige og nøyaktige doseringen av de enkelte komponentene er uunnværlig når man sikter etter mest mulig identiske reaksjonsbetingelser. I tillegg til en god pipetteringsteknikk er det avgjørende å velge riktig verktøy. PCR-masterblandinger inneholder ofte stoffer som øker viskositeten eller danner skum. Under pipeteringsprosessen fører disse til betydelig fukting avpipettespisser, og dermed redusere pipetteringsnøyaktigheten. Bruk av direkte dispenseringssystemer eller alternative pipettespisser som er mindre utsatt for fukting, kan forbedre nøyaktigheten og presisjonen i pipetteprosessen.
Forurensninger
Under dispenseringsprosessen genereres det aerosoler som, hvis de tillates å nå innsiden av pipetten, potensielt kan forurense en annen prøve under neste pipeteringstrinn. Dette kan forhindres ved å bruke filterspisser eller direkte forskyvningssystemer.
Forbruksvarer som f.ekstips, kar og plater som brukes i PCR-arbeidsflyten må ikke inneholde stoffer som kompromitterer prøven eller forfalsker resultatet. Disse inkluderer DNA, DNaser, RNaser og PCR-hemmere, samt komponenter som potensielt kan lekke ut fra materialet under reaksjonen – stoffer kjent som utlutbare stoffer.
Brukerfeil
Jo flere prøver som behandles, jo høyere er feilrisikoen. Det kan lett skje at en prøve pipetteres i feil kar eller feil brønn. Denne risikoen kan reduseres betraktelig ved lett merkbar merking av brønnene. Gjennom automatisering av dispenseringstrinn minimeres den "menneskelige faktoren", dvs. feil og brukerrelaterte variasjoner, og øker dermed reproduserbarheten, spesielt ved små reaksjonsvolumer. Dette krever plater med tilstrekkelig dimensjonsstabilitet for å kunne brukes i en arbeidsstasjon. Vedlagte strekkoder gir ekstra maskinlesbarhet, noe som forenkler prøvesporing gjennom hele prosessen.
Programmering av termosykleren
Programmering av et instrument kan vise seg å være tidkrevende så vel som feilutsatt. Ulike PCR termiske syklusfunksjoner jobber sammen for å forenkle dette prosesstrinnet og, viktigst av alt, for å gjøre det trygt:
Enkel betjening og god brukerveiledning er grunnlaget for effektiv programmering. Ved å bygge på dette grunnlaget vil passordbeskyttet brukeradministrasjon forhindre at ens egne programmer endres av andre brukere. Hvis flere syklere (av samme type) er i bruk, er det fordelaktig om et program kan overføres direkte fra ett instrument til et annet via USB eller tilkobling. Dataprogramvare muliggjør sentral og sikker administrasjon av programmer, brukerrettigheter og dokumenter på en datamaskin.
PCR-kjøring
Under kjøringen amplifiseres DNA i reaksjonskaret, hvor hver prøve skal utsettes for identiske, konsistente reaksjonsbetingelser. Følgende aspekter er relevante for prosessen:
Temperaturkontroll
Utmerket nøyaktighet i temperaturkontroll og homogenitet til syklusblokken er grunnlaget for jevn temperaturkondisjonering av alle prøver. Den høye kvaliteten på varme- og kjøleelementene (peltier-elementer), samt måten disse kobles til blokken på, er de avgjørende faktorene som vil avgjøre risikoen for temperaturavvik kjent som "kanteffekten"
Fordampning
Konsentrasjonene av de enkelte reaksjonskomponentene bør ikke endres i løpet av reaksjonen på grunn av fordampning. Ellers er det mulig at veldig litePCR-produktkan genereres, eller ingen i det hele tatt. Det er derfor avgjørende å minimere fordampning ved å sikre en sikker forsegling. I dette tilfellet fungerer det oppvarmede lokket på termosykleren og forseglingen på fartøyet hånd i hånd. Ulike tetningsalternativer er tilgjengelige forPCR-plater (lenke: Forseglingsartikkel), hvorved den beste forseglingen oppnås gjennom varmeforsegling. Andre lukkinger kan også være egnet, så lenge kontakttrykket til sykluslokket kan justeres til den valgte tetningen.
Prosessstandardisering er på plass for å sikre nøyaktige og reproduserbare resultater på lang sikt. Dette inkluderer regelmessig vedlikehold av utstyret for å sikre at det alltid er i god stand. Alle forbruksvarer bør være av konsekvent høy kvalitet på tvers av alle partier som produseres, og pålitelig tilgjengelighet må garanteres.
Innleggstid: 29. november 2022