Nukleinsyreekstraksjon og den magnetiske perlemetoden

Introduksjon

Hva er nukleinsyreekstraksjon?

I det aller enkleste uttrykket er nukleinsyreekstraksjon fjerning av RNA og/eller DNA fra en prøve og alt overskuddet som ikke er nødvendig. Ekstraksjonsprosessen isolerer nukleinsyrene fra en prøve og gir dem i form av et konsentrert eluat, fritt for fortynningsmidler og forurensninger som kan påvirke eventuelle nedstrømsapplikasjoner.

Anvendelser av nukleinsyreekstraksjon

Rensede nukleinsyrer brukes i en mengde forskjellige applikasjoner, som spenner over flere forskjellige bransjer. Helsetjenester er kanskje det området hvor det brukes mest, med renset RNA og DNA som kreves for en rekke forskjellige testformål.

Anvendelser av nukleinsyreekstraksjon i helsevesenet inkluderer:

- PCR og qPCR Amplifikasjon

- Neste generasjons sekvensering (NGS)

- Amplifikasjonsbasert SNP Genotyping

- Array-basert genotyping

- Restriksjon enzymfordøyelse

- Analyser ved hjelp av modifiserende enzymer (f.eks. ligering og kloning)

Det er også andre felt utover helsevesenet der nukleinsyreekstraksjon brukes, inkludert men ikke begrenset til farskapstesting, rettsmedisin og genomikk.

En kort historie om nukleinsyreekstraksjon

DNA-ekstraksjondateres langt tilbake, med den første kjente isolasjonen som ble utført av en sveitsisk lege ved navn Friedrich Miescher i 1869. Miescher håpet å løse de grunnleggende livsprinsippene ved å bestemme den kjemiske sammensetningen av celler. Etter å ha feilet med lymfocytter, var han i stand til å få et rått bunnfall av DNA fra leukocytter funnet i puss på kasserte bandasjer. Han gjorde dette ved å tilsette syre og deretter alkali til cellen for å forlate cellens cytoplasma, og utviklet deretter en protokoll for å skille DNA fra de andre proteinene.

Etter Mieschers banebrytende forskning, har mange andre forskere gått videre med å fremme og utvikle teknikker for å isolere og rense DNA. Edwin Joseph Cohn, en proteinforsker utviklet mange teknikker for proteinrensing under andre verdenskrig. Han var ansvarlig for å isolere serumalbuminfraksjonen i blodplasma, som er viktig for å opprettholde det osmotiske trykket i blodårene. Dette var avgjørende for å holde soldatene i live.

I 1953 bestemte Francis Crick, sammen med Rosalind Franklin og James Watson, strukturen til DNA, og viste at det var bygd opp av to tråder av lange kjeder av nukleinsyrenukleotider. Denne banebrytende oppdagelsen banet vei for Meselson og Stahl, som var i stand til å utvikle en sentrifugeringsprotokoll for tetthetsgradienter for å isolere DNA fra E. Coli-bakterier da de demonstrerte den semi-konservative replikasjonen av DNA under deres eksperiment fra 1958.

Teknikker for nukleinsyreekstraksjon

Hva er de 4 stadiene av DNA-ekstraksjon?
Alle utvinningsmetoder koker ned til de samme grunnleggende trinnene.

Celleforstyrrelse. Dette stadiet, også kjent som cellelyse, innebærer å bryte ned celleveggen og/eller cellemembranen, for å frigjøre de intracellulære væskene som inneholder nukleinsyrene av interesse.

Fjerning av uønsket rusk. Dette inkluderer membranlipider, proteiner og andre uønskede nukleinsyrer som kan forstyrre nedstrømsapplikasjoner.

Isolering. Det finnes en rekke forskjellige måter å isolere nukleinsyrene av interesse fra det rensede lysatet du opprettet, som faller mellom to hovedkategorier: løsningsbasert eller fast tilstand (se neste avsnitt).

Konsentrasjon. Etter at nukleinsyrene er blitt isolert fra alle andre forurensninger og fortynningsmidler, presenteres de i et høykonsentrert eluat.

De to typene utvinning
Det er to typer nukleinsyreekstraksjon - løsningsbaserte metoder og faststoffmetoder. Den løsningsbaserte metoden er også kjent som den kjemiske ekstraksjonsmetoden, da den innebærer å bruke kjemikalier for å bryte ned cellen og få tilgang til nukleinmaterialet. Dette kan være å bruke enten organiske forbindelser som fenol og kloroform, eller de mindre skadelige og derfor mer anbefalte uorganiske forbindelsene som Proteinase K eller silikagel.

Eksempler på forskjellige kjemiske utvinningsmetoder for å bryte ned en celle inkluderer:

- Osmotisk brudd på membran

- Enzymatisk fordøyelse av cellevegg

- Solubilisering av membran

- Med vaskemidler

- Med alkalibehandling

Faststoffteknikker, også kjent som mekaniske metoder, innebærer å utnytte hvordan DNA samhandler med et fast substrat. Ved å velge en perle eller molekyl som DNA-et vil binde seg til, men analytten ikke vil, er det mulig å skille de to. Eksempler på fastfase-ekstraksjonsteknikker inkludert bruk av silika og magnetiske perler.

Magnetisk perleekstraksjon forklart

Den magnetiske perleekstraksjonsmetoden
Potensialet for utvinning ved bruk av magnetiske perler ble først anerkjent i et amerikansk patent inngitt av Trevor Hawkins, for Whitehead Institute forskningsinstitusjon. Dette patentet anerkjente at det var mulig å trekke ut genetisk materiale ved å binde dem til en solid bærer, som kan være en magnetisk perle. Prinsippet er at du bruker en svært funksjonalisert magnetisk perle som det genetiske materialet vil binde seg til, som deretter kan skilles fra supernatanten ved å påføre en magnetisk kraft på utsiden av karet som holder prøven.

Hvorfor bruke magnetisk perleekstraksjon?
Magnetisk perleekstraksjonsteknologi blir stadig mer utbredt, på grunn av potensialet det har for raske og effektive ekstraksjonsprosedyrer. I nyere tid har det vært utviklinger av svært funksjonaliserte magnetiske kuler med passende buffersystemer, som har muliggjort automatisering av nukleinsyreekstraksjon og en arbeidsflyt som er svært ressurslett og kostnadseffektiv. Også magnetiske perleekstraksjonsmetoder involverer ikke sentrifugeringstrinnene som kan forårsake skjærkrefter som bryter opp lengre DNA-stykker. Dette betyr at lengre DNA-tråder forblir intakte, noe som er viktig i genomisk testing.