Selv om i teorien, vil ett molekyl av malen være tilstrekkelig, brukes betydelig større mengder DNA typisk for en klassisk PCR, for eksempel opptil 1 ug genomisk pattedyr -DNA og så lite som 1 pg plasmid -DNA. Den optimale mengden avhenger i stor grad av antall kopier av målsekvensen, så vel som av dens kompleksitet.
Hvis det brukes veldig lite mal, vil det være nødvendig med en tilsvarende økning i antall forsterkningssykluser for å oppnå en tilstrekkelig mengde produkt. En TAQ-polymerase som brukes til de fleste PCR-eksperimenter har ikke en korreksjonsfunksjon (3′-5 ′ eksonukleaseaktivitet); Dermed kan ikke feil som oppstår under forsterkning rettes opp. Jo høyere antall sykluser, desto mer utbredt vil forsterkningen av feil produkt være. Hvis mengden malmengde er for høy, vil sannsynligheten for at primere annealing til andre (ikke hundre prosent gratis) sekvenser, så vel som dannelsen av primerdimerer, vil øke, noe som vil resultere i amplifisering av biprodukter. I mange tilfeller er DNA isolert fra cellekulturer eller fra mikroorganismer og deretter brukt som en PCR -mal. Etter rensing er det nødvendig å bestemme konsentrasjonen av DNA for å kunne definere volumet som er nødvendig for PCR -oppsettet. Mens agarosegelelektroforese kan tjene til å gi et estimat, er denne metoden langt fra nøyaktig. UV-vis spektrofotometri er etablert som gullstandard for kvantifisering av nukleinsyrer; Denne direkte og derfor enkle og raske metoden måler absorbansen av prøven ved 260 nm, og konsentrasjonen beregnes ved hjelp av en konverteringsfaktor.
Hvis DNA -konsentrasjonen er veldig lav, men (<1 ug/ml dsDNA), eller hvis den er forurenset med stoffer som også absorberer i området 260 nm (f.eks. RNA, protein, salter), vil denne metoden nå sine begrensninger. Når det gjelder svært lave konsentrasjoner, vil avlesningene snart bli for unøyaktige til å være til nytte, og forurensninger vil føre til (noen ganger enorm) overvurdering av den faktiske verdien. I dette tilfellet kan kvantifisering ved bruk av fluorescens presentere et alternativ. Denne teknikken er basert på bruk av et lysstofffarge som binder seg spesielt til dsDNA bare komplekset som omfatter nukleinsyre og fargestoff blir begeistret av lyset, og den vil deretter avgi lys av en litt høyere bølgelengde. Her er intensiteten til det fluorescerende signalet proporsjonalt med mengden DNA, og for å bestemme konsentrasjonen blir det evaluert i forhold til en standardkurve. Fordelene med denne metoden hviler på bindingsens spesifisitet, som utelukker de ytre påvirkningene som er introdusert ved forurensning, så vel som på den resulterende evnen til å oppdage svært lave konsentrasjoner av DNA. Egnetheten til en av metoden avhenger hovedsakelig av prøvekonsentrasjon og renhet; I mange tilfeller kan det til og med være tilrådelig å anvende begge metodene parallelt.
Post Time: Nov-30-2022