Voor succesvolle amplificatiereacties is het noodzakelijk dat de afzonderlijke reactiecomponenten in elk preparaat in de juiste concentratie aanwezig zijn. Daarnaast is het belangrijk dat er geen verontreiniging optreedt.
Vooral als er veel reacties moeten worden opgezet, is het gebruikelijk om een zogenaamde mastermix te bereiden in plaats van elk reagens afzonderlijk in elk vat te pipetteren. Er zijn voorgeconfigureerde mengsels in de handel verkrijgbaar, waarin alleen monsterspecifieke componenten (primer) en water worden toegevoegd. Als alternatief kan de mastermix zelf worden bereid. In beide varianten wordt het mengsel zonder template over elk PCR-vat verdeeld en wordt het individuele DNA-monster aan het einde afzonderlijk toegevoegd.
Het gebruik van een mastermix heeft verschillende voordelen: Ten eerste wordt het aantal afzonderlijke pipetteerstappen verminderd. Op deze manier wordt zowel het risico op gebruikersfouten tijdens het pipetteren als het risico op contaminatie geminimaliseerd en wordt uiteraard tijd bespaard. In principe is ook de pipetteernauwkeurigheid hoger, omdat er grotere volumes gedoseerd worden. Dit is gemakkelijk te begrijpen bij het controleren van de technische gegevens van pipetten: hoe kleiner het gedoseerde volume, hoe groter de afwijkingen kunnen zijn. Het feit dat alle bereidingen uit hetzelfde vat komen, heeft een positief effect op de homogeniteit (mits goed gemengd). Dit verbetert ook de reproduceerbaarheid van de experimenten.
Bij het bereiden van de mastermix moet minimaal 10% extra volume worden toegevoegd (bijvoorbeeld als er 10 bereidingen nodig zijn, reken dan op basis van 11), zodat zelfs het laatste bakje goed gevuld is. Op deze manier kunnen (kleine) pipetteeronnauwkeurigheden en het effect van monsterverlies bij het doseren van wasmiddelhoudende oplossingen worden gecompenseerd. Wasmiddelen zitten in enzymoplossingen zoals polymerasen en mastermixen, waardoor schuimvorming en resten op het binnenoppervlak van normalepipetpunten.
Afhankelijk van de toepassing en het type vloeistof dat moet worden gedoseerd, moet de juiste pipetteertechniek (1) worden gekozen en de juiste apparatuur worden geselecteerd. Voor oplossingen die reinigingsmiddelen bevatten, worden een direct verplaatsingssysteem of de zogenaamde “low retentie” pipetpunten aanbevolen als alternatief voor luchtkussenpipetten. Het effect vanACE PIPETTE-tipis gebaseerd op een bijzonder hydrofoob oppervlak. Vloeistoffen die reinigingsmiddelen bevatten laten zowel binnen als buiten geen restfilm achter, waardoor het verlies aan oplossing tot een minimum kan worden beperkt.
Naast het exact doseren van alle componenten is het ook belangrijk dat er geen vervuiling van de preparaten optreedt. Het is niet voldoende om verbruiksartikelen met een hoge zuiverheid te gebruiken, omdat bij het pipetteren in een luchtkussenpipet aërosolen kunnen ontstaan die in de pipet achterblijven. Het DNA dat zich eventueel in de aerosol bevindt, kan bij de volgende pipetteerstap van het ene monster naar het andere worden overgebracht en zo tot besmetting leiden. De bovengenoemde directe verplaatsingssystemen kunnen dit risico ook minimaliseren. Voor luchtkussenpipetten is het zinvol om filtertips te gebruiken om de pipetkegel te beschermen door spatten, aerosolen en biomoleculen tegen te houden.
Posttijd: 06-dec-2022