Cryovialsworden vaak gebruikt voor de cryogene opslag van cellijnen en andere kritische biologische materialen, in dewars gevuld met vloeibare stikstof.

Er zijn verschillende fasen betrokken bij het succesvol conserveren van cellen in vloeibare stikstof. Hoewel het basisprincipe een langzame bevriezing is, hangt de exacte gebruikte techniek af van het celtype en het gebruikte cryoprotectant. Er zijn verschillende veiligheidsoverwegingen en best practices waarmee u rekening moet houden bij het opslaan van cellen bij zulke lage temperaturen.

Dit bericht is bedoeld om een ​​overzicht te geven van hoe cryovials worden opgeslagen in vloeibare stikstof.

Wat zijn cryovials

Cryovials zijn kleine flesjes met dop, ontworpen voor het bewaren van vloeibare monsters bij extreem lage temperaturen. Ze zorgen ervoor dat cellen die in cryoprotectant zijn bewaard niet in direct contact komen met de vloeibare stikstof, waardoor het risico op cellulaire breuken wordt geminimaliseerd en toch wordt geprofiteerd van het extreme verkoelende effect van vloeibare stikstof.

De injectieflacons zijn doorgaans verkrijgbaar in een reeks volumes en uitvoeringen – ze kunnen zowel intern als extern van schroefdraad zijn voorzien met platte of ronde bodems. Er zijn ook steriele en niet-steriele formaten beschikbaar.

Wie gebruiktCyrovialenom cellen op te slaan in vloeibare stikstof

Een reeks NHS- en particuliere laboratoria, evenals onderzoeksinstellingen die gespecialiseerd zijn in navelstrengbloedbanken, epitheliale celbiologie, immunologie en stamcelbiologie, gebruiken cryovials om cellen te cryopreserveren.

Op deze manier geconserveerde cellen omvatten B- en T-cellen, CHO-cellen, hematopoïetische stam- en voorlopercellen, hybridoma's, darmcellen, macrofagen, mesenchymale stam- en voorlopercellen, monocyten, myeloom, NK-cellen en pluripotente stamcellen.

Overzicht van hoe u cryovials in vloeibare stikstof bewaart

Cryopreservatie is een proces waarbij cellen en andere biologische constructies worden geconserveerd door ze tot zeer lage temperaturen af ​​te koelen. Cellen kunnen jarenlang in vloeibare stikstof worden bewaard zonder verlies van levensvatbaarheid van de cellen. Dit is een overzicht van de gehanteerde procedures.

Celvoorbereiding

De exacte methode voor het bereiden van monsters zal variëren afhankelijk van het celtype, maar over het algemeen worden de cellen verzameld en gecentrifugeerd om een ​​celrijke pellet te ontwikkelen. Deze pellet wordt vervolgens opnieuw gesuspendeerd in het supernatant gemengd met cryoprotectant of een cryoconserveringsmedium.

Cryopreservatiemedium

Dit medium wordt gebruikt om cellen te behouden in de omgevingen met lage temperaturen waaraan ze zullen worden blootgesteld, door de vorming van intra- en extracellulaire kristallen en daarmee de celdood te remmen. Hun rol is het bieden van een veilige, beschermende omgeving voor cellen en weefsels tijdens het invriezen, bewaren en ontdooien.

Een medium zoals vers ingevroren plasma (FFP), gehepariniseerde plasmalytoplossing of serumvrije oplossingen zonder dierlijke componenten wordt gemengd met cryoprotectanten zoals dimethylsulfoxide (DMSO) of glycerol.

De opnieuw vloeibaar gemaakte monsterpellet wordt verdeeld in cryovials van polypropyleen, zoalsSuzhou Ace Biomedisch bedrijf Cryogene opslagflesjes.

Het is belangrijk om de cryovials niet te vol te doen, omdat dit het risico op barsten en het mogelijk vrijkomen van de inhoud vergroot (1).

Gecontroleerde bevriezingssnelheid

Over het algemeen wordt voor de succesvolle cryopreservatie van cellen een langzame gecontroleerde vriessnelheid gebruikt.

Nadat de monsters in cryogene flesjes zijn verdeeld, worden ze op nat ijs of in een koelkast van 4 °C geplaatst en wordt de invriesprocedure binnen 5 minuten gestart. Als algemene richtlijn worden cellen gekoeld met een snelheid van -1 tot -3 per minuut (2). Dit wordt bereikt met behulp van een programmeerbare koeler of door injectieflacons in een geïsoleerde doos in een vriezer met gecontroleerde snelheid van –70°C tot –90°C te plaatsen.

Overbrengen naar vloeibare stikstof

De bevroren cryogene flesjes worden vervolgens voor onbepaalde tijd overgebracht naar een tank met vloeibare stikstof, op voorwaarde dat een temperatuur van minder dan -135℃ wordt gehandhaafd.

Deze ultralage temperaturen kunnen worden verkregen door onderdompeling in stikstof in de vloeibare of dampfase.

Vloeistof- of dampfase?

Het is bekend dat opslag in stikstof in de vloeibare fase de koude temperatuur met absolute consistentie handhaaft, maar wordt vaak niet aanbevolen om de volgende redenen:

• De behoefte aan grote volumes (diepte) vloeibare stikstof, wat een potentieel gevaar vormt. Verbrandingen of verstikking zijn hierdoor een reëel risico.
• Gedocumenteerde gevallen van kruisbesmetting door infectieuze agentia zoals aspergillus, hep B en virale verspreiding via het vloeibare stikstofmedium (2,3)
• De kans dat vloeibare stikstof tijdens onderdompeling in de flesjes lekt. Wanneer het uit de opslag wordt gehaald en tot kamertemperatuur wordt verwarmd, zet de stikstof snel uit. Bijgevolg kan het flesje versplinteren wanneer het uit de opslag van vloeibare stikstof wordt gehaald, waardoor gevaar ontstaat door rondvliegend puin en blootstelling aan de inhoud (1, 4).

Om deze redenen vindt opslag bij ultralage temperaturen meestal plaats in stikstof in de dampfase. Wanneer monsters in de vloeibare fase moeten worden bewaard, moeten gespecialiseerde cryoflex-slangen worden gebruikt.

Het nadeel van de dampfase is dat er een verticale temperatuurgradiënt kan optreden, wat resulteert in temperatuurschommelingen tussen -135℃ en -190℃. Dit vereist een zorgvuldige en zorgvuldige monitoring van de niveaus van vloeibare stikstof en temperatuurschommelingen (5).

Veel fabrikanten adviseren dat cryovials geschikt zijn voor opslag tot -135℃ of alleen voor gebruik in de dampfase.

Uw gecryopreserveerde cellen ontdooien

De ontdooiprocedure is stressvol voor een bevroren cultuur, en een juiste behandeling en techniek zijn vereist om optimale levensvatbaarheid, herstel en functionaliteit van de cellen te garanderen. De exacte ontdooiprotocollen zijn afhankelijk van specifieke celtypen. Snel ontdooien wordt echter als standaard beschouwd om:

• Verminder de impact op het celherstel
• Help de blootstellingstijd aan de opgeloste stoffen in de vriesmedia te verminderen
• Minimaliseer eventuele schade door herkristallisatie van ijs

Waterbaden, kralenbaden of gespecialiseerde geautomatiseerde instrumenten worden vaak gebruikt om monsters te ontdooien.

Meestal wordt 1 cellijn per keer ontdooid gedurende 1-2 minuten, door zachtjes rond te draaien in een waterbad van 37℃ totdat er nog maar een klein beetje ijs in het flesje zit voordat ze worden gewassen in een voorverwarmd groeimedium.

Voor sommige cellen, zoals embryo's van zoogdieren, is langzame opwarming essentieel voor hun overleving.

De cellen zijn nu klaar voor celcultuur, celisolatie of, in het geval van hematopoëtische stamcellen, levensvatbaarheidsstudies om de integriteit van de donorstamcellen vóór myeloablatieve therapie te garanderen.

Het is een normale praktijk om kleine hoeveelheden van het voorgewassen monster te nemen die worden gebruikt om een ​​celtelling uit te voeren om de celconcentraties voor uitplaten in de kweek te bepalen. Vervolgens kunt u de resultaten van celisolatieprocedures beoordelen en de levensvatbaarheid van de cellen bepalen.

Beste praktijken voor de opslag van cryovials

De succesvolle cryopreservatie van monsters die zijn opgeslagen in cryovials hangt af van veel elementen in het protocol, waaronder de juiste opslag en het bijhouden van gegevens.

• Splits cellen tussen opslaglocaties– Als de volumes dit toelaten, verdeel de cellen dan over flesjes en bewaar ze op aparte locaties om het risico op monsterverlies als gevolg van apparatuurstoringen te verminderen.
• Voorkom kruisbesmetting– Kies voor steriele cryogene injectieflacons voor eenmalig gebruik of autoclaaf vóór volgend gebruik
• Gebruik flesjes van de juiste grootte voor uw cellen– injectieflacons zijn verkrijgbaar in verschillende volumes tussen 1 en 5 ml. Vermijd het overvullen van injectieflacons om het risico op barsten te verminderen.
• Selecteer cryogene vials met interne of externe schroefdraad– Vials met interne schroefdraad worden door sommige universiteiten aanbevolen vanwege veiligheidsmaatregelen – ze kunnen ook besmetting voorkomen tijdens het vullen of wanneer ze worden bewaard in vloeibare stikstof.
• Voorkom lekkage- Gebruik bi-geïnjecteerde afdichtingen die in de schroefdop of O-ringen zijn gegoten om lekken en vervuiling te voorkomen.
• Gebruik 2D-barcodes en etiketteer flesjes– om de traceerbaarheid te garanderen, zorgen flacons met grote schrijfvlakken ervoor dat elke flacon adequaat kan worden geëtiketteerd. 2D-barcodes kunnen helpen bij opslagbeheer en het bijhouden van gegevens. Kleurgecodeerde doppen zijn handig voor eenvoudiger identificatie.
• Voldoende opslagonderhoud- Om ervoor te zorgen dat cellen niet verloren gaan, moeten opslagvaten voortdurend de temperatuur en het niveau van vloeibare stikstof controleren. Er moeten alarmen worden geplaatst om gebruikers op fouten te wijzen.

Veiligheidsmaatregelen

Vloeibare stikstof is in modern onderzoek een gangbare praktijk geworden, maar brengt bij verkeerd gebruik het risico met zich mee van ernstig letsel.

Er moeten goede persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM's) worden gedragen om het risico op bevriezing, brandwonden en andere nadelige incidenten bij het hanteren van vloeibare stikstof te minimaliseren. Dragen

• Cryogene handschoenen
• Laboratorium jas
• Slagvast volgelaatsscherm dat ook de nek bedekt
• Schoenen met gesloten neus
• Spatwaterdicht kunststof schort

Koelkasten met vloeibare stikstof moeten in goed geventileerde ruimtes worden geplaatst om het risico op verstikking te minimaliseren – ontsnapte stikstof verdampt en verdringt zuurstof uit de lucht. Winkels met een groot volume moeten alarmsystemen voor een laag zuurstofniveau hebben.

Het werken in paren bij de omgang met vloeibare stikstof is ideaal en het gebruik ervan buiten de normale werkuren moet verboden worden.

Cryovials om uw workflow te ondersteunen

Het bedrijf Suzhou Ace Biomedical biedt een brede selectie producten die voldoen aan uw cryopreservatiebehoeften voor verschillende soorten cellen. Het portfolio omvat een reeks buizen en een reeks steriele cryovials.

Onze cryovials zijn:

• Lab-schroefdop 0,5 ml 1,5 ml 2,0 ml Cryoviale cryogene flesjes Cryobuis met conische bodem met pakking

  ● 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml specificatie, met rok of zonder rok
  ● Conisch of op zichzelf staand ontwerp, steriel of niet-steriel zijn beide verkrijgbaar
  ● Buizen met schroefdop zijn gemaakt van polypropyleen van medische kwaliteit
  ● PP Cryotube-flesjes kunnen herhaaldelijk worden ingevroren en ontdooid
  ●Het ontwerp van de externe dop kan de kans op besmetting tijdens monsterbehandeling verminderen.
  ● Cryogene buizen met schroefdop Universele schroefdraad voor gebruik
  ● Buizen passen op de meeste gangbare rotors
  ● O-ringbuizen voor cryogene buizen passen in standaard 1-inch en 2-inch, 48well, 81well, 96well en 100well vrieskisten
  ● Autoclaveerbaar tot 121°C en invriesbaar tot -86°C

  ONDERDEELNR	MATERIAAL	VOLUME	GLBKLEUR	STUKS/TAS	TASSEN/KOFFER
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Zwart, geel, blauw, rood, paars, wit	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Zwart, geel, blauw, rood, paars, wit	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Zwart, geel, blauw, rood, paars, wit	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Zwart, geel, blauw, rood, paars, wit	500	10