Standaardisatie van processen omvat de optimalisatie en daaropvolgende vaststelling en harmonisatie ervan, waardoor optimale prestaties op lange termijn mogelijk zijn – onafhankelijk van de gebruiker. Standaardisatie garandeert resultaten van hoge kwaliteit, evenals hun reproduceerbaarheid en vergelijkbaarheid.
Het doel van (klassieke) PCR is het genereren van een betrouwbaar en reproduceerbaar resultaat. Voor bepaalde toepassingen kan de opbrengst van dePCR-productis ook relevant. Bij deze reacties moet ervoor worden gezorgd dat monsters niet worden aangetast en dat de PCR-workflow stabiel blijft. Dit betekent met name dat de introductie van contaminaties die tot vals-positieve of vals-negatieve resultaten kunnen leiden of zelfs de PCR-reactie kunnen belemmeren, tot een minimum wordt beperkt. Bovendien moeten de reactieomstandigheden voor elk afzonderlijk monster binnen een run zo identiek mogelijk zijn en ook overdraagbaar zijn naar volgende reacties (van dezelfde methode). Dit geldt zowel voor de samenstelling van de reacties als voor het type temperatuurregeling in de cycler. Gebruikersfouten moeten uiteraard zoveel mogelijk worden vermeden.
Hieronder beschrijven we de uitdagingen die u tegenkomt tijdens de voorbereiding en uitvoering van een PCR. Ook bespreken we de oplossingsmethoden die er zijn voor instrumenten en verbruiksartikelen die worden gebruikt voor de standaardisatie van PCR-workflows.
Reactievoorbereiding
Het doseren van reactiecomponenten in PCR-vaten of -platen brengt verschillende uitdagingen met zich mee die overwonnen moeten worden:
Reactieomstandigheden
De exacte en precieze dosering van de afzonderlijke componenten is onmisbaar bij het streven naar zo identiek mogelijke reactieomstandigheden. Naast een goede pipetteertechniek is de keuze van het juiste gereedschap cruciaal. PCR-mastermixen bevatten vaak stoffen die de viscositeit verhogen of schuim genereren. Tijdens het pipetteerproces leiden deze tot aanzienlijke bevochtiging van de vloeistof.pipetpunten, waardoor de pipetteernauwkeurigheid afneemt. Het gebruik van directe doseersystemen of alternatieve pipetpunten die minder gevoelig zijn voor bevochtiging, kan de nauwkeurigheid en precisie van het pipetteerproces verbeteren.
Verontreinigingen
Tijdens het doseerproces ontstaan aerosolen die, indien ze de binnenkant van de pipet bereiken, mogelijk een ander monster kunnen besmetten tijdens de volgende pipetteerstap. Dit kan worden voorkomen door het gebruik van filtertips of directe-verdringingssystemen.
Verbruiksartikelen zoalstipsVaten en platen die in de PCR-workflow worden gebruikt, mogen geen stoffen bevatten die het monster aantasten of het resultaat vervalsen. Hieronder vallen DNA, DNases, RNases en PCR-remmers, evenals componenten die tijdens de reactie mogelijk uit het materiaal kunnen lekken – stoffen die bekend staan als leachables.
Gebruikersfout
Hoe meer monsters er worden verwerkt, hoe groter het risico op fouten. Het kan gemakkelijk gebeuren dat een monster in het verkeerde vat of de verkeerde well wordt gepipetteerd. Dit risico kan aanzienlijk worden verminderd door de wells duidelijk te markeren. Door de automatisering van doseerstappen wordt de "menselijke factor", d.w.z. fouten en gebruikersgerelateerde variaties, geminimaliseerd, waardoor de reproduceerbaarheid toeneemt, vooral bij kleine reactievolumes. Dit vereist platen met voldoende maatvastheid voor gebruik in een werkstation. Aangehechte barcodes zorgen voor extra machineleesbaarheid, wat de monstertracering gedurende het hele proces vereenvoudigt.
Programmering van de thermocycler
Het programmeren van een instrument kan tijdrovend en foutgevoelig zijn. Verschillende functies van de PCR-thermocycler werken samen om deze processtap te vereenvoudigen en, nog belangrijker, om het veilig te maken:
Eenvoudige bediening en goede gebruikersbegeleiding vormen de basis voor efficiënte programmering. Voortbouwend op deze basis voorkomt wachtwoordbeveiligd gebruikersbeheer dat eigen programma's door andere gebruikers worden gewijzigd. Bij gebruik van meerdere cyclers (van hetzelfde type) is het handig als een programma rechtstreeks van het ene instrument naar het andere kan worden overgezet via USB of connectiviteit. Computersoftware maakt centraal en veilig beheer van programma's, gebruikersrechten en documenten op een computer mogelijk.
PCR-run
Tijdens de run wordt DNA geamplificeerd in het reactievat, waar elk monster aan identieke, consistente reactieomstandigheden wordt onderworpen. De volgende aspecten zijn relevant voor het proces:
Temperatuurregeling
Uitstekende nauwkeurigheid in temperatuurregeling en homogeniteit van het cyclerblok vormen de basis voor een gelijkmatige temperatuurconditionering van alle monsters. De hoge kwaliteit van de verwarmings- en koelelementen (peltierelementen), evenals de manier waarop deze met het blok zijn verbonden, zijn de doorslaggevende factoren die het risico op temperatuurverschillen, ook wel het "randeffect" genoemd, bepalen.
Verdamping
De concentraties van de afzonderlijke reactiecomponenten mogen tijdens de reactie niet veranderen door verdamping. Anders is het mogelijk dat er zeer weinigPCR-productkan worden gegenereerd, of helemaal niet. Het is daarom cruciaal om verdamping te minimaliseren door te zorgen voor een veilige afdichting. In dit geval werken het verwarmde deksel van de thermocycler en de afdichting van het vat hand in hand. Er zijn verschillende afdichtingsopties beschikbaar voorPCR-platen (link: artikel over verzegeling), waarbij de beste afdichting wordt bereikt door middel van hittesealen. Andere sluitingen kunnen ook geschikt zijn, zolang de contactdruk van het deksel van de cycler kan worden aangepast aan de gekozen afdichting.
Processtandaardisatie is van kracht om nauwkeurige en reproduceerbare resultaten op de lange termijn te waarborgen. Dit omvat regelmatig onderhoud van de apparatuur om ervoor te zorgen dat deze altijd in goede staat verkeert. Alle verbruiksartikelen moeten van een consistent hoge kwaliteit zijn voor alle geproduceerde partijen en hun betrouwbare beschikbaarheid moet gegarandeerd zijn.
Plaatsingstijd: 29-11-2022