Invoering
Wat is nucleïnezuurextractie?
In de eenvoudigste bewoordingen is nucleïnezuurextractie het verwijderen van het RNA en/of DNA uit een monster en al het overtollige dat niet nodig is. Het extractieproces isoleert de nucleïnezuren uit een monster en levert ze op in de vorm van een geconcentreerd eluaat, vrij van verdunningsmiddelen en verontreinigingen die eventuele vervolgtoepassingen kunnen beïnvloeden.
Toepassingen van nucleïnezuurextractie
Gezuiverde nucleïnezuren worden gebruikt in een overvloed aan verschillende toepassingen, variërend in meerdere verschillende industrieën. De gezondheidszorg is misschien wel het gebied waar dit het meest wordt gebruikt, waarbij gezuiverd RNA en DNA nodig zijn voor een groot aantal verschillende testdoeleinden.
Toepassingen van nucleïnezuurextractie in de gezondheidszorg zijn onder meer:
- Sequencing van de volgende generatie (NGS)
- Op amplificatie gebaseerde SNP-genotypering
- Array-gebaseerde genotypering
- Beperking van de vertering van enzymen
- Analyses met behulp van modificerende enzymen (bijv. Ligatie en klonen)
Er zijn ook andere gebieden buiten de gezondheidszorg waar nucleïnezuurextractie wordt gebruikt, inclusief maar niet beperkt tot vaderschapstesten, forensisch onderzoek en genomica.
Een korte geschiedenis van de extractie van nucleïnezuren
DNA-extractiegaat ver terug, waarbij de eerste bekende isolatie werd uitgevoerd door een Zwitserse arts genaamd Friedrich Miescher in 1869. Miescher hoopte de fundamentele principes van het leven op te lossen door de chemische samenstelling van cellen te bepalen. Nadat de lymfocyten niet waren gelukt, kon hij een ruw DNA-neerslag verkrijgen uit leukocyten die in de pus op weggegooide verbanden werden aangetroffen. Hij deed dit door zuur en vervolgens alkali aan de cel toe te voegen om het cytoplasma van de cel te verlaten, en ontwikkelde vervolgens een protocol om het DNA van de andere eiwitten te scheiden.
Na het baanbrekende onderzoek van Miescher hebben veel andere wetenschappers technieken ontwikkeld en ontwikkeld om DNA te isoleren en te zuiveren. Edwin Joseph Cohn, een eiwitwetenschapper, ontwikkelde tijdens de Tweede Wereldoorlog veel technieken voor eiwitzuivering. Hij was verantwoordelijk voor het isoleren van de serumalbuminefractie van bloedplasma, wat belangrijk is voor het op peil houden van de osmotische druk in de bloedvaten. Dit was cruciaal om soldaten in leven te houden.
In 1953 bepaalde Francis Crick, samen met Rosalind Franklin en James Watson, de structuur van DNA, waarbij hij aantoonde dat het bestond uit twee strengen van lange ketens van nucleïnezuurnucleotiden. Deze baanbrekende ontdekking maakte de weg vrij voor Meselson en Stahl, die in staat waren een dichtheidsgradiëntcentrifugatieprotocol te ontwikkelen om DNA uit E. Coli-bacteriën te isoleren, terwijl ze tijdens hun experiment uit 1958 de semi-conservatieve replicatie van DNA aantoonden.
Technieken van nucleïnezuurextractie
Wat zijn de 4 stadia van DNA-extractie?
Alle extractiemethoden komen neer op dezelfde fundamentele stappen.
Celverstoring. Deze fase, ook bekend als cellyse, omvat het afbreken van de celwand en/of het celmembraan, om de intracellulaire vloeistoffen vrij te geven die de nucleïnezuren van belang bevatten.
Verwijdering van ongewenst vuil. Dit omvat membraanlipiden, eiwitten en andere ongewenste nucleïnezuren die de downstream-toepassingen kunnen verstoren.
Isolatie. Er zijn een aantal verschillende manieren om de nucleïnezuren van belang te isoleren uit het geklaarde lysaat dat u hebt gemaakt, die tussen twee hoofdcategorieën vallen: oplossingsgebaseerd of vaste toestand (zie volgende sectie).
Concentratie. Nadat de nucleïnezuren zijn geïsoleerd van alle andere verontreinigingen en verdunningsmiddelen, worden ze gepresenteerd in een hooggeconcentreerd eluaat.
De twee soorten extractie
Er zijn twee soorten nucleïnezuurextractie: op oplossing gebaseerde methoden en methoden in vaste toestand. De op oplossing gebaseerde methode staat ook bekend als de chemische extractiemethode, omdat hierbij chemicaliën worden gebruikt om de cel af te breken en toegang te krijgen tot het kernmateriaal. Hierbij kan gebruik worden gemaakt van organische verbindingen zoals fenol en chloroform, of van de minder schadelijke en daarom meer aanbevolen anorganische verbindingen zoals Proteinase K of silicagel.
Voorbeelden van verschillende chemische extractiemethoden om een cel af te breken zijn:
- Osmotische breuk van het membraan
- Enzymatische vertering van celwand
- Oplossen van membraan
- Met wasmiddelen
- Met alkalibehandeling
Vastestoftechnieken, ook wel mechanische methoden genoemd, omvatten het exploiteren van de interactie van DNA met een vast substraat. Door een kraal of molecuul te selecteren waaraan het DNA wel zal binden, maar de analyt niet, is het mogelijk om de twee te scheiden. Voorbeelden van vaste-fase-extractietechnieken, waaronder het gebruik van silica en magnetische kralen.
Magnetische parelextractie uitgelegd
De magnetische parelextractiemethode
Het potentieel voor extractie met behulp van magnetische kralen werd voor het eerst erkend in een Amerikaans patent dat door Trevor Hawkins was ingediend voor de onderzoeksinstelling van het Whitehead Institute. Dit patent erkende dat het mogelijk was genetisch materiaal te extraheren door het te binden aan een vaste drager, bijvoorbeeld een magnetische kraal. Het principe is dat je een hooggefunctionaliseerde magnetische kraal gebruikt waaraan het genetisch materiaal zich zal hechten. Deze kraal kan vervolgens van het supernatant worden gescheiden door een magnetische kracht uit te oefenen op de buitenkant van het vat waarin het monster zich bevindt.
Waarom magnetische parelextractie gebruiken?
Magnetische parelextractietechnologie wordt steeds gangbaarder vanwege het potentieel dat deze biedt voor snelle en efficiënte extractieprocedures. De laatste tijd zijn er ontwikkelingen geweest van sterk gefunctionaliseerde magnetische korrels met geschikte buffersystemen, die automatisering van de extractie van nucleïnezuren mogelijk hebben gemaakt en een workflow die zeer weinig hulpbronnen bevat en kostenefficiënt is. Bovendien omvatten magnetische kralenextractiemethoden geen centrifugatiestappen die schuifkrachten kunnen veroorzaken die langere stukken DNA opbreken. Dit betekent dat langere DNA-strengen intact blijven, wat belangrijk is bij genomics-testen.
Posttijd: 25 november 2022