Hoewel in theorie één molecuul van de sjabloon voldoende zou zijn, worden aanzienlijk grotere hoeveelheden DNA meestal gebruikt voor een klassieke PCR, bijvoorbeeld tot 1 µg genomisch DNA van zoogdieren en slechts 1 pg plasmide -DNA. De optimale hoeveelheid hangt grotendeels af van het aantal kopieën van de doelsequentie, evenals van de complexiteit ervan.
Als er zeer weinig sjabloon wordt gebruikt, is een overeenkomstige toename van het aantal amplificatiecycli nodig om een voldoende hoeveelheid product te verkrijgen. Een TAQ-polymerase dat wordt gebruikt voor de meeste PCR-experimenten heeft geen correctiefunctie (3'-5 ′ exonuclease-activiteit); Aldus kunnen fouten die optreden tijdens amplificatie niet worden gecorrigeerd. Hoe hoger het aantal cycli, hoe groter de versterking van het gebrekkig product. Als aan de andere kant de hoeveelheid sjabloon te hoog is, zullen de kans dat primers gloeien naar andere (niet honderd procent complementaire) sequenties, evenals de vorming van primer -dimeren, toeneemt, wat zal resulteren in de versterking van de versterking van de versterking van bijproducten. In veel gevallen wordt DNA geïsoleerd uit celculturen of uit micro -organismen en vervolgens gebruikt als een PCR -sjabloon. Na zuivering is het noodzakelijk om de concentratie van het DNA te bepalen om het volume te definiëren dat vereist is voor de PCR -opstelling. Hoewel agarosegelelektroforese kan dienen om een schatting te geven, is deze methode verre van nauwkeurig. UV-vis spectrofotometrie is vastgesteld als de gouden standaard voor de kwantificering van nucleïnezuren; Deze directe en daarom eenvoudige en snelle methode meet de absorptie van het monster bij 260 nm en concentratie wordt berekend met behulp van een conversiefactor.
Als de DNA -concentratie echter erg laag is (<1 µg/ml dsDNA), of als deze is verontreinigd met stoffen die ook absorberen in het 260 nm -bereik (bijv. RNA, eiwit, zouten), zal deze methode zijn beperkingen bereiken. In het geval van zeer lage concentraties zullen de metingen binnenkort te onnauwkeurig worden om van nut te zijn, en verontreinigingen zullen leiden tot (soms enorme) overschatting van de werkelijke waarde. In dit geval kan kwantificering met behulp van fluorescentie een alternatief opleveren. Deze techniek is gebaseerd op het gebruik van een fluorescerende kleurstof die specifiek bindt aan dsDNA, alleen het complex dat nucleïnezuur omvat en kleurstof wordt geëxciteerd door het licht, en het zal vervolgens het licht uitzenden van een iets hogere golflengte. Hier is de intensiteit van het fluorescerende signaal evenredig met de hoeveelheid DNA, en voor het bepalen van de concentratie wordt deze geëvalueerd in relatie tot een standaardcurve. De voordelen van deze methode berusten op de specificiteit van de binding, die de externe invloeden uitsluit die geïntroduceerd door besmetting, evenals het resulterende vermogen om zeer lage DNA -concentraties te detecteren. De geschiktheid van beide methoden hangt voornamelijk af van de monsterconcentratie en zuiverheid; In veel gevallen kan het zelfs raadzaam zijn om beide methoden parallel toe te passen.
Posttijd: nov-30-2022