यद्यपि सिद्धान्तमा, टेम्प्लेटको एक अणु पर्याप्त हुनेछ, DNA को धेरै ठूलो मात्रा सामान्यतया क्लासिक PCR को लागी प्रयोग गरिन्छ, उदाहरण को लागी, 1 µg जीनोमिक स्तनधारी DNA सम्म र प्लाज्मिड DNA को 1 pg सम्म। इष्टतम रकम धेरै हदसम्म लक्ष्य अनुक्रम को प्रतिलिपि संख्या, साथै यसको जटिलता मा निर्भर गर्दछ।
यदि धेरै थोरै टेम्प्लेट प्रयोग गरिन्छ भने, पर्याप्त मात्रामा उत्पादन प्राप्त गर्न एम्प्लीफिकेशन चक्रहरूको संख्यामा समान वृद्धि आवश्यक हुनेछ। धेरै PCR प्रयोगहरूका लागि प्रयोग गरिने Taq पोलिमरेजले सुधार कार्य (3′-5′ exonuclease गतिविधि) देखाउँदैन; यसरी, एम्प्लीफिकेशनको समयमा हुने त्रुटिहरू सच्याउन सकिँदैन। चक्रको संख्या जति बढी हुन्छ, त्रुटिपूर्ण उत्पादनको प्रवर्धन त्यति नै प्रचलित हुन्छ। यदि, अर्कोतर्फ, टेम्प्लेटको मात्रा धेरै उच्च छ भने, प्राइमरहरू अन्य (सत प्रतिशत मानार्थ होइन) अनुक्रमहरूमा एनेल गर्ने सम्भावना, साथसाथै प्राइमर डाइमरहरूको गठन बढ्नेछ, जसले प्रवर्द्धनमा परिणत हुनेछ। उप-उत्पादनहरू। धेरै अवस्थामा, DNA कोशिका संस्कृतिहरू वा सूक्ष्मजीवहरूबाट अलग गरिन्छ र पछि PCR टेम्प्लेटको रूपमा प्रयोग गरिन्छ। शुद्धीकरण पछि, PCR सेटअपको लागि आवश्यक भोल्युम परिभाषित गर्न सक्षम हुन DNA को एकाग्रता निर्धारण गर्न आवश्यक छ। जबकि agarose जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस एक अनुमान प्रदान गर्न सेवा गर्न सक्छ, यो विधि सही देखि टाढा छ। UV-Vis स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रीलाई न्यूक्लिक एसिडको परिमाणीकरणको लागि सुनको मानकको रूपमा स्थापित गरिएको छ; यो प्रत्यक्ष र त्यसैले सजिलो र द्रुत विधिले 260 nm मा नमूनाको अवशोषण मापन गर्दछ, र एकाग्रता रूपान्तरण कारकको मद्दतले गणना गरिन्छ।
यदि DNA एकाग्रता धेरै कम छ, यद्यपि (< 1 µg/mL dsDNA), वा यदि यो 260 nm दायरा (जस्तै RNA, प्रोटीन, लवण) मा अवशोषित गर्ने पदार्थहरूसँग दूषित छ भने, यो विधि यसको सीमिततामा पुग्नेछ। धेरै कम सांद्रताको अवस्थामा, पठनहरू चाँडै प्रयोगको लागि धेरै गलत हुनेछन्, र प्रदूषितहरूले वास्तविक मूल्यको (कहिलेकाहीँ ठूलो) अत्यधिक मूल्याङ्कनको नेतृत्व गर्नेछ। यस अवस्थामा, प्रतिदीप्ति प्रयोग गरेर परिमाणीकरणले वैकल्पिक प्रस्तुत गर्न सक्छ। यो प्रविधि फ्लोरोसेन्ट डाईको प्रयोगमा आधारित छ जुन विशेष गरी dsDNA मा बाँधिएको हुन्छ जसमा न्यूक्लिक एसिड र डाई समावेश भएको कम्प्लेक्स प्रकाशले उत्तेजित हुन्छ, र यसले पछि थोरै उच्च तरंगदैर्ध्यको प्रकाश उत्सर्जन गर्दछ। यहाँ, फ्लोरोसेन्ट संकेत को तीव्रता DNA को मात्रा को समानुपातिक छ, र एकाग्रता निर्धारण को लागी यो मानक वक्र को सम्बन्ध मा मूल्याङ्कन गरिन्छ। यस विधिका फाइदाहरू बन्डको विशिष्टतामा निर्भर छन्, जसले दूषित पदार्थद्वारा प्रस्तुत बाह्य प्रभावहरू समावेश गर्दैन, साथै DNA को धेरै कम सांद्रता पत्ता लगाउने परिणामस्वरूप क्षमतामा। कुनै पनि विधिको उपयुक्तता मुख्यतया नमूना एकाग्रता र शुद्धतामा निर्भर गर्दछ; धेरै अवस्थामा दुवै विधिहरू समानान्तर रूपमा लागू गर्न पनि उचित हुन सक्छ।
पोस्ट समय: नोभेम्बर-30-2022