Estrazzjoni ta 'aċidu nuklejiku u l-metodu ta' żibeġ manjetiku

Introduzzjoni

X'inhi l-estrazzjoni tal-aċidu nuklejku?

Fl-aktar termini sempliċi, l-estrazzjoni tal-aċidu nuklejiku hija t-tneħħija tal-RNA u / jew tad-DNA minn kampjun u l-eċċess kollu li mhux meħtieġ. Il-proċess ta 'estrazzjoni jiżola l-aċidi nuklejiċi minn kampjun u jrendihom fil-forma ta' eluat ikkonċentrat, ħieles minn dilwenti u kontaminanti li jistgħu jaffettwaw kwalunkwe applikazzjoni 'l isfel.

Applikazzjonijiet ta 'estrazzjoni ta' aċidu nuklejku

L-aċidi nuklejiċi purifikati jintużaw fi numru kbir ta 'applikazzjonijiet differenti, li jvarjaw f'industriji differenti multipli. Il-kura tas-saħħa hija forsi l-qasam fejn jintuża l-iktar, bl-RNA purifikat u d-DNA meħtieġa għal għadd ta 'skopijiet differenti ta' ttestjar.

Applikazzjonijiet ta 'estrazzjoni ta' aċidu nuklejku fil-kura tas-saħħa jinkludu:

- Amplifikazzjoni PCR u qPCR

- Sekwenzar tal-Ġenerazzjoni li Jmiss (NGS)

- Ġenotipar SNP ibbażat fuq l-amplifikazzjoni

- Ġenotipar ibbażat fuq il-firxa

- Restrizzjoni Diġestjoni ta 'Enżima

- Analiżijiet bl-użu ta 'enzimi li jimmodifikaw (eż. Ligazzjoni u klonazzjoni)

Hemm ukoll oqsma oħra lil hinn mill-kura tas-saħħa fejn tintuża l-estrazzjoni tal-aċidu nuklejku, inkluż iżda mhux limitata għall-ittestjar tal-paternità, il-forensika u l-ġenomika.

Storja qasira ta 'estrazzjoni ta' aċidu nuklejku

Estrazzjoni tad-DNADati lura 'l bogħod, bl-ewwel iżolament magħruf ġie mwettaq minn tabib Żvizzeru jismu Friedrich Miescher fl-1869. Miescher kien qed jittama li jsolvi l-prinċipji fundamentali tal-ħajja billi jiddetermina l-kompożizzjoni kimika taċ-ċelloli. Wara li naqas bil-limfoċiti, huwa kien kapaċi jikseb preċipitat mhux raffinat ta 'DNA minn lewkokiti misjuba fil-pus fuq faxex mormija. Għamel dan billi żied l-aċidu u mbagħad l-alkali maċ-ċellula biex iħalli ċ-ċitoplasma taċ-ċellula, u mbagħad żviluppa protokoll biex jissepara d-DNA mill-proteini l-oħra.

Wara r-riċerka innovattiva ta 'Miescher, bosta xjenzati oħra komplew javvanzaw u jiżviluppaw tekniki biex jiżolaw u jippurifikaw id-DNA. Edwin Joseph Cohn, xjenzat tal-proteina żviluppa ħafna tekniki għall-purifikazzjoni tal-proteina matul WW2. Huwa kien responsabbli għall-iżolament tal-frazzjoni tal-albumina fis-serum tal-plażma tad-demm, li hija importanti fiż-żamma tal-pressjoni osmotika fil-vini tad-demm. Dan kien kruċjali biex iżommu s-suldati ħajjin.

Fl-1953 Francis Crick, flimkien ma 'Rosalind Franklin u James Watson, iddeterminaw l-istruttura tad-DNA, li juru li kienet magħmula minn żewġ linji ta' ktajjen twal ta 'nukleotidi ta' aċidu nuklejku. Din l-iskoperta avvanzata wittiet it-triq għal Meselson u Stahl, li setgħu jiżviluppaw protokoll ta 'ċentrifugazzjoni ta' gradjent ta 'densità biex jiżolaw id-DNA mill-batterja E. coli hekk kif urew ir-replikazzjoni semi-konservattiva tad-DNA matul l-esperiment tagħhom fl-1958.

Tekniki ta 'estrazzjoni ta' aċidu nuklejku

X'inhuma l-4 stadji ta 'estrazzjoni tad-DNA?
Il-metodi kollha ta 'estrazzjoni jonqsu għall-istess passi fundamentali.

Tfixkil taċ-ċellula- Dan l-istadju, magħruf ukoll bħala lisi taċ-ċellula, jinvolvi li jitkissru l-ħajt taċ-ċellula u / jew il-membrana taċ-ċellula, sabiex teħles il-fluwidi intra-ċellulari li fihom l-aċidi nuklejiċi ta 'interess.

Tneħħija ta 'fdalijiet mhux mixtieqa. Dan jinkludi lipidi tal-membrana, proteini u aċidi nuklejiċi oħra mhux mixtieqa li jistgħu jinterferixxu ma 'applikazzjonijiet downstream.

Iżolament. Hemm numru ta 'modi differenti biex jiżolaw l-aċidi nuklejiċi ta' interess mil-lisat ikklerjat li ħloqt, li jaqgħu bejn żewġ kategoriji ewlenin: Soluzzjoni bbażata jew stat solidu (ara t-taqsima li jmiss).

Konċentrazzjoni. Wara li l-aċidi nuklejiċi jkunu ġew iżolati mill-kontaminanti u d-dilwenti l-oħra kollha, huma ppreżentati f'numru konċentrat ħafna.

Iż-żewġ tipi ta 'estrazzjoni
Hemm żewġ tipi ta 'metodi bbażati fuq is-soluzzjoni ta' estrazzjoni ta 'aċidu nuklejiku u metodi ta' stat solidu. Il-metodu bbażat fuq is-soluzzjoni huwa magħruf ukoll bħala l-metodu ta 'estrazzjoni kimika, peress li jinvolvi l-użu ta' kimiċi biex tkisser iċ-ċellula u taċċessa l-materjal nuklejiku. Dan jista 'jkun jew komposti organiċi bħal fenol u kloroform, jew il-komposti inorganiċi inqas ta' ħsara u għalhekk aktar rakkomandati bħal proteinase K jew ġel tas-silika.

Eżempji ta 'metodi ta' estrazzjoni kimika differenti biex jitkissru ċellola jinkludu:

- It-tifrik osmotiku tal-membrana

- Diġestjoni enżimatika tal-ħajt taċ-ċellula

- Solubilizzazzjoni tal-membrana

- b'deterġenti

- bi trattament alkali

Tekniki ta 'stat solidu, magħrufa wkoll bħala metodi mekkaniċi, jinvolvu l-isfruttar ta' kif id-DNA jinteraġixxi ma 'sottostrat solidu. Billi tagħżel xoffa jew molekula li d-DNA se jorbot fuqha iżda l-analit mhux se, huwa possibbli li tissepara t-tnejn. Eżempji ta 'tekniki ta' estrazzjoni ta 'fażi solida inklużi l-użu ta' żibeġ tas-silika u manjetiċi.

Estrazzjoni manjetika ta 'żibeġ spjegata

Il-metodu ta 'estrazzjoni taż-żibeġ manjetiku
Il-potenzjal għall-estrazzjoni bl-użu ta 'żibeġ manjetiċi ġie rikonoxxut l-ewwel fi privattiva Amerikana ppreżentata minn Trevor Hawkins, għall-Istituzzjoni ta' Riċerka dwar l-Istitut ta 'Whitehead. Dan il-brevett irrikonoxxa li kien possibbli li jiġi estratt materjal ġenetiku billi jorbothom ma 'trasportatur ta' appoġġ solidu, li jista 'jkun żibġa manjetika. Il-prinċipju huwa li tuża xoffa manjetika funzjonalizzata ħafna li fuqha l-materjal ġenetiku se jorbot fuq, li mbagħad jista 'jkun separat mis-supernatant billi tapplika forza manjetika fuq barra tal-bastiment li jkollu l-kampjun.

Għaliex tuża estrazzjoni manjetika taż-żibeġ?
It-teknoloġija tal-estrazzjoni taż-żibeġ manjetiku qed issir dejjem aktar prevalenti, minħabba l-potenzjal li żżomm għal proċeduri ta 'estrazzjoni rapidi u effiċjenti. Fi żminijiet riċenti kien hemm żviluppi ta 'żibeġ manjetiċi funzjonalizzati ħafna b'sistemi ta' buffer xierqa, li għamlu possibbli awtomazzjoni ta 'estrazzjoni ta' aċidu nuklejku u fluss ta 'xogħol li huwa ħafna dawl tar-riżorsi u kost-effiċjenti. Ukoll, metodi ta 'estrazzjoni ta' żibeġ manjetiku ma jinvolvux il-passi ta 'ċentrifugazzjoni li jistgħu jikkawżaw forzi ta' shear li jkissru biċċiet itwal ta 'DNA. Dan ifisser li linji itwal ta 'DNA jibqgħu intatti, li huwa importanti fl-ittestjar tal-ġenomika.