Introduzzjoni
X'inhi l-Estrazzjoni tal-Aċidu Nukleiku?
Fl-aktar termini sempliċi, l-estrazzjoni tal-aċidu nuklejku hija t-tneħħija tal-RNA u/jew DNA minn kampjun u l-eċċess kollu li mhux meħtieġ. Il-proċess ta' estrazzjoni jiżola l-aċidi nuklejċi minn kampjun u jagħtihom fil-forma ta' eluat konċentrat, ħieles minn dilwenti u kontaminanti li jistgħu jaffettwaw kwalunkwe applikazzjonijiet downstream.
Applikazzjonijiet ta' Estrazzjoni ta' Aċidu Nukleiku
L-aċidi nuklejċi purifikati jintużaw f'għadd kbir ta' applikazzjonijiet differenti, li jvarjaw f'diversi industriji differenti. Il-kura tas-saħħa hija forsi l-qasam fejn tintuża l-aktar, b’RNA u DNA purifikati meħtieġa għal għadd ta’ skopijiet ta’ ttestjar differenti.
L-applikazzjonijiet tal-estrazzjoni tal-aċidu nuklejku fil-kura tas-saħħa jinkludu:
- Amplifikazzjoni tal-PCR u qPCR
- Sekwenzar tal-Ġenerazzjoni li Jmiss (NGS)
- SNP Genotyping ibbażat fuq l-amplifikazzjoni
- Ġenotipar ibbażat fuq Array
- Restrizzjoni Enżima Diġestjoni
- Analiżi bl-użu ta' Enżimi li Jmodifikaw (eż. Ligazzjoni u Klonazzjoni)
Hemm ukoll oqsma oħra lil hinn mill-kura tas-saħħa fejn tintuża l-estrazzjoni tal-aċidu nuklejku, inklużi iżda mhux limitati għall-ittestjar tal-paternità, il-forensika u l-ġenomika.
Storja qasira ta 'estrazzjoni ta' Aċidu Nuklejku
Estrazzjoni tad-DNAjmur lura ħafna, bl-ewwel iżolament magħruf sar minn tabib Żvizzeru jismu Friedrich Miescher fl-1869. Miescher kien qed jittama li jsolvi l-prinċipji fundamentali tal-ħajja billi jiddetermina l-kompożizzjoni kimika taċ-ċelloli. Wara li falla bil-limfoċiti, huwa kien kapaċi jikseb preċipitat mhux raffinat ta 'DNA minn lewkoċiti misjuba fi timbotta fuq faxex mormija. Huwa għamel dan billi żied aċidu u mbagħad alkali maċ-ċellula biex iħalli ċ-ċitoplasma taċ-ċellula, u mbagħad żviluppa protokoll biex tissepara d-DNA mill-proteini l-oħra.
Wara r-riċerka innovattiva ta 'Miescher, ħafna xjenzati oħra komplew javvanzaw u żviluppaw tekniki biex jiżolaw u jippurifikaw id-DNA. Edwin Joseph Cohn, xjenzat tal-proteini żviluppa ħafna tekniki għall-purifikazzjoni tal-proteini matul it-Tieni WW2. Huwa kien responsabbli biex iżola l-frazzjoni tal-albumina tas-serum tal-plażma tad-demm, li hija importanti biex tinżamm il-pressjoni osmotika fil-vini tad-demm. Dan kien kruċjali biex is-suldati jinżammu ħajjin.
Fl-1953 Francis Crick, flimkien ma’ Rosalind Franklin u James Watson, iddeterminaw l-istruttura tad-DNA, u wera li kienet magħmula minn żewġ linji ta’ ktajjen twal ta’ nukleotidi ta’ aċidu nuklejku. Din l-iskoperta rivoluzzjonarja witta t-triq għal Meselson u Stahl, li setgħu jiżviluppaw protokoll ta’ ċentrifugazzjoni tal-gradjent tad-densità biex jiżolaw id-DNA minn batterji E. Coli hekk kif urew ir-replikazzjoni semi-konservattiva tad-DNA matul l-esperiment tagħhom tal-1958.
Tekniki ta' Estrazzjoni ta' Aċidu Nuklejku
X'inhuma l-4 stadji tal-estrazzjoni tad-DNA?
Il-metodi kollha ta 'estrazzjoni jitnaqqsu għall-istess passi fundamentali.
Tfixkil taċ-Ċelloli. Dan l-istadju, magħruf ukoll bħala liżi taċ-ċelluli, jinvolvi t-tkissir tal-ħajt taċ-ċellula u/jew il-membrana taċ-ċellula, sabiex jiġu rilaxxati l-fluwidi intra-ċellulari li fihom l-aċidi nuklejċi ta 'interess.
Tneħħija ta' Debris mhux mixtieqa. Dan jinkludi lipidi tal-membrana, proteini u aċidi nuklejċi oħra mhux mixtieqa li jistgħu jinterferixxu ma 'applikazzjonijiet downstream.
Iżolament. Hemm għadd ta' modi differenti biex tiżola l-aċidi nuklejċi ta' interess mil-lisat ikklerjat li ħloqt, li jaqgħu bejn żewġ kategoriji ewlenin: ibbażat fuq soluzzjoni jew stat solidu (ara t-taqsima li jmiss).
Konċentrazzjoni. Wara li l-aċidi nuklejċi jkunu ġew iżolati mill-kontaminanti u dilwenti l-oħra kollha, huma ppreżentati f'eluat ikkonċentrat ħafna.
Iż-Żewġ Tipi ta' Estrazzjoni
Hemm żewġ tipi ta 'estrazzjoni ta' aċidu nuklejku - metodi bbażati fuq soluzzjoni u metodi ta 'stat solidu. Il-metodu bbażat fuq is-soluzzjoni huwa magħruf ukoll bħala l-metodu ta 'estrazzjoni kimika, peress li jinvolvi l-użu ta' kimiċi biex ikissru ċ-ċellula u jaċċessaw il-materjal nuklejku. Dan jista 'jkun bl-użu jew komposti organiċi bħall-fenol u l-kloroform, jew il-komposti inorganiċi inqas ta' ħsara u għalhekk aktar rakkomandati bħal Proteinase K jew ġel tas-silika.
Eżempji ta’ metodi ta’ estrazzjoni kimika differenti biex tkisser ċellula jinkludu:
- Tkissir osmotiku tal-membrana
- Diġestjoni enżimatika tal-ħajt taċ-ċelluli
- Solubilizzazzjoni tal-membrana
- B'deterġenti
- Bi trattament alkali
Tekniki ta 'stat solidu, magħrufa wkoll bħala metodi mekkaniċi, jinvolvi l-isfruttament ta' kif id-DNA jinteraġixxi ma 'sottostrat solidu. Billi tagħżel xoffa jew molekula li d-DNA se jorbot fuqha iżda l-analite le, huwa possibbli li jiġu separati t-tnejn. Eżempji ta 'tekniki ta' estrazzjoni ta 'fażi solida inkluż l-użu tas-silika u żibeġ manjetiċi.
Estrazzjoni ta 'Xoffa Manjetika Spjegata
Il-Metodu ta' Estrazzjoni ta 'Xoffa Manjetika
Il-potenzjal għall-estrazzjoni bl-użu ta 'żibeġ manjetiċi ġie rikonoxxut l-ewwel fi privattiva Amerikana ppreżentata minn Trevor Hawkins, għall-istituzzjoni ta' riċerka tal-Whitehead Institute. Din il-privattiva rrikonoxxiet li kien possibbli li jiġi estratt materjal ġenetiku billi jorbot ma 'trasportatur ta' appoġġ solidu, li jista 'jkun xoffa manjetika. Il-prinċipju huwa li tuża xoffa manjetika funzjonalizzata ħafna li fuqha jingħaqad il-materjal ġenetiku, li mbagħad tista 'tiġi sseparata mis-supernatant billi tapplika forza manjetika fuq barra tar-reċipjent li jżomm il-kampjun.
Għaliex Uża Estrazzjoni ta 'Xoffa Manjetika?
It-teknoloġija ta 'estrazzjoni ta' żibeġ manjetiċi qed issir dejjem aktar prevalenti, minħabba l-potenzjal li għandha għal proċeduri ta 'estrazzjoni mgħaġġla u effiċjenti. Fi żminijiet reċenti kien hemm żviluppi ta 'żibeġ manjetiċi funzjonalizzati ħafna b'sistemi ta' buffer adattati, li għamlu possibbli l-awtomazzjoni tal-estrazzjoni tal-aċidu nuklejku u fluss tax-xogħol li huwa ħafif ħafna fir-riżorsi u kosteffiċjenti. Ukoll, il-metodi ta 'estrazzjoni ta' żibeġ manjetiċi ma jinvolvux il-passi taċ-ċentrifugazzjoni li jistgħu jikkawżaw forzi ta 'shear li jkissru biċċiet itwal ta' DNA. Dan ifisser li linji itwal ta 'DNA jibqgħu intatti, li huwa importanti fl-ittestjar tal-ġenomika.
Ħin tal-post: 25-Nov-2022