Anki jekk fit-teorija, molekula waħda tal-mudell tkun biżżejjed, ammonti konsiderevolment akbar ta 'DNA huma tipikament użati għal PCR klassika, pereżempju, sa 1 µg ta' DNA tal-mammiferi ġenomika u mill-inqas 1 pg ta 'DNA tal-plasmid. L-aħjar ammont jiddependi ħafna fuq in-numru ta 'kopji tas-sekwenza fil-mira, kif ukoll fuq il-kumplessità tagħha.
Jekk jintuża ftit template, tkun meħtieġa żieda korrispondenti fin-numru ta' ċikli ta' amplifikazzjoni biex jinkiseb ammont suffiċjenti ta' prodott. Polimerażi Taq li tintuża għall-biċċa l-kbira tal-esperimenti PCR ma għandhiex funzjoni ta 'korrezzjoni (attività ta' exonuclease 3′-5′); għalhekk, żbalji li jseħħu waqt l-amplifikazzjoni ma jistgħux jiġu kkoreġuti. Aktar ma jkun għoli n-numru ta 'ċikli, iktar tkun prevalenti l-amplifikazzjoni tal-prodott difettuż. Jekk, min-naħa l-oħra, l-ammont ta 'mudell huwa għoli wisq, il-probabbiltà ta' primers ittemprar għal sekwenzi oħra (mhux mija fil-mija kumplimentari), kif ukoll il-formazzjoni ta 'dimeri primer, se tiżdied, li tirriżulta fl-amplifikazzjoni ta' prodotti sekondarji. F'ħafna każijiet, id-DNA huwa iżolat minn kulturi ta 'ċelluli jew minn mikro-organiżmi u sussegwentement użat bħala mudell PCR. Wara l-purifikazzjoni, huwa meħtieġ li tiddetermina l-konċentrazzjoni tad-DNA biex tkun tista 'tiddefinixxi l-volum li huwa meħtieġ għas-setup tal-PCR. Filwaqt li l-elettroforeżi tal-ġel tal-agarose tista 'sservi biex tipprovdi stima, dan il-metodu huwa 'l bogħod milli jkun preċiż. L-ispettrofotometrija UV-Vis ġiet stabbilita bħala l-istandard tad-deheb għall-kwantifikazzjoni ta 'aċidi nuklejċi; dan il-metodu dirett u għalhekk faċli u rapidu jkejjel l-assorbiment tal-kampjun f'260 nm, u l-konċentrazzjoni hija kkalkulata bl-għajnuna ta 'fattur ta' konverżjoni.
Jekk il-konċentrazzjoni tad-DNA hija baxxa ħafna, madankollu (< 1 µg/mL dsDNA), jew jekk tkun ikkontaminata b'sustanzi li jassorbu wkoll fil-medda ta' 260 nm (eż. RNA, proteini, imluħa), dan il-metodu jilħaq il-limitazzjonijiet tiegħu. Fil-każ ta' konċentrazzjonijiet baxxi ħafna, il-qari dalwaqt isir mhux preċiż wisq biex ikun ta' użu, u l-kontaminazzjonijiet iwasslu għal stima żejda (xi kultant enormi) tal-valur attwali. F'dan il-każ, kwantifikazzjoni bl-użu ta' fluworexxenza tista' tippreżenta alternattiva. Din it-teknika hija bbażata fuq l-użu ta 'żebgħa fluworexxenti li torbot speċifikament mad-dsDNA biss il-kumpless li jinkludi l-aċidu nuklejku u ż-żebgħa huwa eċċitati mid-dawl, u sussegwentement se jarmu dawl ta' wavelength kemmxejn ogħla. Hawnhekk, l-intensità tas-sinjal fluworexxenti hija proporzjonali għall-ammont ta 'DNA, u għad-determinazzjoni tal-konċentrazzjoni hija evalwata b'relazzjoni ma' kurva standard. Il-vantaġġi ta 'dan il-metodu jistrieħu fuq l-ispeċifiċità tar-rabta, li teskludi l-influwenzi esterni introdotti mill-kontaminazzjoni, kif ukoll fuq il-kapaċità li tirriżulta li tiskopri konċentrazzjonijiet baxxi ħafna ta' DNA. L-adegwatezza ta' kwalunkwe metodu tiddependi prinċipalment fuq il-konċentrazzjoni u l-purità tal-kampjun; f'ħafna każijiet jista' jkun saħansitra rakkomandabbli li jiġu applikati ż-żewġ metodi b'mod parallel.
Ħin tal-post: Nov-30-2022