Anke jekk fit-teorija, molekula waħda tal-mudell tkun biżżejjed, ammonti konsiderevolment ikbar ta 'DNA huma tipikament użati għal PCR klassika, pereżempju, sa 1 µg ta' DNA mammiferu ġenomiku u inqas minn 1 pg ta 'DNA tal-plażmidi. L-ammont ottimali jiddependi ħafna fuq in-numru ta 'kopji tas-sekwenza fil-mira, kif ukoll fuq il-kumplessità tiegħu.
Jekk jintuża ftit template, se tkun meħtieġa żieda korrispondenti fl-għadd ta 'ċikli ta' amplifikazzjoni biex jinkiseb ammont suffiċjenti ta 'prodott. Polimerażi TAQ li tintuża għall-biċċa l-kbira tal-esperimenti tal-PCR ma għandhax funzjoni ta 'korrezzjoni (attività ta' eżonukleżiżi 3′-5 '); Għalhekk, żbalji li jseħħu waqt l-amplifikazzjoni ma jistgħux jiġu kkoreġuti. Aktar ma jkun għoli n-numru ta 'ċikli, iktar tkun prevalenti l-amplifikazzjoni tal-prodott difettuż. Jekk, min-naħa l-oħra, l-ammont ta 'mudell huwa għoli wisq, il-probabbiltà li l-primer jiġu ttremprati għal sekwenzi oħra (mhux mija fil-mija kumplimentari), kif ukoll il-formazzjoni ta' dimers tal-primer, se jiżdiedu, li jirriżultaw fl-amplifikazzjoni ta ' prodotti sekondarji. F’ħafna każijiet, id-DNA huwa iżolat mill-kulturi taċ-ċelloli jew minn mikro-organiżmi u sussegwentement użat bħala mudell PCR. Wara l-purifikazzjoni, huwa meħtieġ li tiġi ddeterminata l-konċentrazzjoni tad-DNA biex tkun tista 'tiddefinixxi l-volum li huwa meħtieġ għas-setup tal-PCR. Filwaqt li l-elettroforeżi tal-ġel ta 'agarose tista' sservi biex tipprovdi stima, dan il-metodu huwa 'l bogħod minn preċiż. L-ispettrofotometrija UV-vis ġiet stabbilita bħala l-istandard tad-deheb għall-kwantifikazzjoni ta 'aċidi nuklejiċi; Dan il-metodu dirett u faċli u rapidu jkejjel l-assorbenza tal-kampjun f'260 nm, u l-konċentrazzjoni hija kkalkulata bl-għajnuna ta 'fattur ta' konverżjoni.
Jekk il-konċentrazzjoni tad-DNA hija baxxa ħafna, madankollu (<1 µg / mL dsDNA), jew jekk tkun ikkontaminata b'sustanzi li jassorbu wkoll fil-medda ta '260 nm (eż. RNA, proteina, melħ), dan il-metodu jilħaq il-limitazzjonijiet tiegħu. Fil-każ ta 'konċentrazzjonijiet baxxi ħafna, il-qari dalwaqt se jsir wisq mhux eżatt biex jintuża, u l-kontaminazzjonijiet iwasslu għal stima żejda (xi kultant enormi) tal-valur attwali. F'dan il-każ, il-kwantifikazzjoni bl-użu ta 'fluworexxenza tista' tippreżenta alternattiva. Din it-teknika hija bbażata fuq l-użu ta 'żebgħa fluworexxenti li torbot speċifikament ma' dsDNA biss il-kumpless li jinkludi l-aċidu nuklejku u ż-żebgħa huwa eċċitat bid-dawl, u sussegwentement se jarmi dawl ta 'tul ta' mewġa kemmxejn ogħla. Hawnhekk, l-intensità tas-sinjal fluworexxenti hija proporzjonali għall-ammont ta 'DNA, u għad-determinazzjoni tal-konċentrazzjoni hija evalwata fir-rigward ta' kurva standard. Il-vantaġġi ta 'dan il-metodu jistrieħu fuq l-ispeċifiċità tal-bond, li teskludi l-influwenzi esterni introdotti mill-kontaminazzjoni, kif ukoll fuq il-kapaċità li tirriżulta li tiskopri konċentrazzjonijiet baxxi ħafna ta' DNA. L-adegwatezza ta 'kwalunkwe metodu tiddependi prinċipalment fuq il-konċentrazzjoni tal-kampjun u l-purità; F’ħafna każijiet jista ’jkun saħansitra rakkomandabbli li jiġu applikati ż-żewġ metodi b’mod parallel.
Ħin ta 'wara: 30-2022 ta' Novembru