Pengenalan
Apakah pengekstrakan asid nukleik?
Dalam istilah yang paling mudah, pengekstrakan asid nukleik adalah penyingkiran RNA dan/atau DNA dari sampel dan semua kelebihan yang tidak diperlukan. Proses pengekstrakan mengasingkan asid nukleik dari sampel dan menghasilkannya dalam bentuk eluate pekat, bebas dari pencairan dan bahan cemar yang boleh mempengaruhi sebarang aplikasi hiliran.
Aplikasi pengekstrakan asid nukleat
Asid nukleik yang disucikan digunakan dalam pelbagai aplikasi yang berbeza, yang merangkumi pelbagai industri yang berbeza. Penjagaan kesihatan mungkin merupakan kawasan di mana ia digunakan paling banyak, dengan RNA dan DNA yang disucikan diperlukan untuk pelbagai tujuan ujian yang berbeza.
Aplikasi pengekstrakan asid nukleik dalam penjagaan kesihatan termasuk:
- Penjujukan Generasi Seterusnya (NGS)
- Genotyping SNP berasaskan amplifikasi
- Genotyping berasaskan array
- Pencernaan enzim sekatan
- Analisis menggunakan enzim yang mengubahsuai (contohnya ligation dan pengklonan)
Terdapat juga bidang lain di luar penjagaan kesihatan di mana pengekstrakan asid nukleik digunakan, termasuk tetapi tidak terhad kepada ujian paterniti, forensik dan genomik.
Sejarah ringkas pengekstrakan asid nukleik
Pengekstrakan DNATarikh kembali jauh, dengan pengasingan pertama yang diketahui telah dilakukan oleh seorang doktor Switzerland bernama Friedrich Miescher pada tahun 1869. Miescher berharap dapat menyelesaikan prinsip -prinsip asas kehidupan dengan menentukan komposisi kimia sel. Setelah gagal dengan limfosit, dia dapat memperoleh mendakan mentah DNA dari leucocytes yang terdapat dalam nanah pada pembalut yang dibuang. Dia melakukan ini dengan menambah asid dan kemudian alkali ke sel untuk meninggalkan sitoplasma sel, dan kemudian membangunkan protokol untuk memisahkan DNA dari protein lain.
Berikutan penyelidikan pemecah tanah Miescher, banyak saintis lain telah pergi untuk memajukan dan mengembangkan teknik untuk mengasingkan dan membersihkan DNA. Edwin Joseph Cohn, seorang saintis protein mengembangkan banyak teknik untuk pemurnian protein semasa WW2. Dia bertanggungjawab untuk mengasingkan serum albumin serum plasma darah, yang penting dalam mengekalkan tekanan osmotik di dalam saluran darah. Ini penting untuk menjaga tentera hidup.
Pada tahun 1953 Francis Crick, bersama dengan Rosalind Franklin dan James Watson, menentukan struktur DNA, menunjukkan bahawa ia terdiri daripada dua helai rantai panjang nukleotida asid nukleik. Penemuan terobosan ini membuka jalan bagi Meselson dan Stahl, yang dapat membangunkan protokol sentrifugasi kecerunan kepadatan untuk mengasingkan DNA dari bakteria E. coli kerana mereka menunjukkan replikasi separuh konservatif DNA semasa percubaan 1958 mereka.
Teknik Pengekstrakan Asid Nukleat
Apakah 4 peringkat pengekstrakan DNA?
Semua kaedah pengekstrakan mendidih ke langkah -langkah asas yang sama.
Gangguan sel. Tahap ini, juga dikenali sebagai lisis sel, melibatkan memecahkan dinding sel dan/atau membran sel, dalam urutan melepaskan cecair intra-selular yang mengandungi asid nukleik yang menarik.
Pembuangan serpihan yang tidak diingini. Ini termasuk lipid membran, protein dan asid nukleik yang tidak diingini yang boleh mengganggu aplikasi hiliran.
Pengasingan. Terdapat beberapa cara yang berbeza untuk mengasingkan asid nukleik yang menarik dari lysate yang dibersihkan yang anda buat, yang jatuh di antara dua kategori utama: penyelesaian berasaskan atau pepejal (lihat bahagian seterusnya).
Konsentrasi. Selepas asid nukleik telah diasingkan dari semua bahan pencemar dan pencairan yang lain, mereka dibentangkan dalam eluate yang sangat berkonsentrasi.
Dua jenis pengekstrakan
Terdapat dua jenis pengekstrakan asid nukleik - kaedah berasaskan penyelesaian dan kaedah keadaan pepejal. Kaedah berasaskan penyelesaian juga dikenali sebagai kaedah pengekstrakan kimia, kerana ia melibatkan penggunaan bahan kimia untuk memecahkan sel dan mengakses bahan nukleik. Ini boleh menggunakan sebatian organik seperti fenol dan kloroform, atau kurang berbahaya dan oleh itu lebih disyorkan sebatian bukan organik seperti proteinase k atau gel silika.
Contoh kaedah pengekstrakan kimia yang berbeza untuk memecahkan sel termasuk:
- Membran membran osmotik
- Pencernaan enzimatik dinding sel
- solubilisasi membran
- dengan detergen
- Dengan rawatan alkali
Teknik keadaan pepejal, juga dikenali sebagai kaedah mekanikal, melibatkan mengeksploitasi bagaimana DNA berinteraksi dengan substrat pepejal. Dengan memilih manik atau molekul yang DNA akan mengikat tetapi analit tidak akan, adalah mungkin untuk memisahkan kedua -duanya. Contoh teknik pengekstrakan fasa pepejal termasuk menggunakan manik silika dan magnet.
Pengekstrakan manik magnetik dijelaskan
Kaedah pengekstrakan manik magnet
Potensi pengekstrakan menggunakan manik magnet pertama kali diiktiraf dalam paten AS yang difailkan oleh Trevor Hawkins, untuk Institusi Penyelidikan Institut Whitehead. Paten ini mengakui bahawa ia mungkin untuk mengekstrak bahan genetik dengan mengikatnya kepada pembawa sokongan yang kukuh, yang boleh menjadi manik magnet. Prinsipnya ialah anda menggunakan manik magnet yang sangat berfungsi di mana bahan genetik akan mengikat ke, yang kemudiannya boleh dipisahkan dari supernatan dengan menggunakan daya magnet ke luar kapal yang memegang sampel.
Mengapa menggunakan pengekstrakan manik magnet?
Teknologi pengekstrakan manik magnet menjadi semakin berleluasa, disebabkan oleh potensi yang dipegangnya untuk prosedur pengekstrakan yang cepat dan cekap. Pada kebelakangan ini terdapat perkembangan manik magnet yang sangat berfungsi dengan sistem penampan yang sesuai, yang telah menjadikan automasi pengekstrakan asid nukleik dan aliran kerja yang sangat ringan dan kos yang sangat penting. Juga, kaedah pengekstrakan manik magnet tidak melibatkan langkah -langkah sentrifugasi yang boleh menyebabkan daya ricih yang memecahkan kepingan DNA yang lebih lama. Ini bermakna bahawa helai DNA yang lebih lama kekal utuh, yang penting dalam ujian genomik.
Masa Post: Nov-25-2022