Walaupun secara teori, satu molekul templat akan mencukupi, jumlah DNA yang jauh lebih besar biasanya digunakan untuk PCR klasik, contohnya, sehingga 1 µg DNA mamalia genomik dan sekurang-kurangnya 1 pg DNA plasmid. Jumlah optimum bergantung sebahagian besarnya pada bilangan salinan jujukan sasaran, serta pada kerumitannya.
Jika templat yang sangat sedikit digunakan, peningkatan yang sepadan dalam bilangan kitaran amplifikasi akan diperlukan untuk mendapatkan jumlah produk yang mencukupi. Polimerase Taq yang digunakan untuk kebanyakan eksperimen PCR tidak menampilkan fungsi pembetulan (aktiviti exonuclease 3′-5′); oleh itu, ralat yang berlaku semasa amplifikasi tidak dapat diperbetulkan. Semakin tinggi bilangan kitaran, semakin berleluasa penguatan produk yang cacat akan berlaku. Jika, sebaliknya, jumlah templat terlalu tinggi, kebarangkalian primer menyelinap ke urutan lain (bukan seratus peratus percuma), serta pembentukan dimer primer, akan meningkat, yang akan mengakibatkan penguatan produk sampingan. Dalam banyak kes, DNA diasingkan daripada kultur sel atau daripada mikroorganisma dan seterusnya digunakan sebagai templat PCR. Selepas penulenan, adalah perlu untuk menentukan kepekatan DNA untuk dapat menentukan isipadu yang diperlukan untuk persediaan PCR. Walaupun elektroforesis gel agarose mungkin berfungsi untuk memberikan anggaran, kaedah ini jauh dari tepat. Spektrofotometri UV-Vis telah ditetapkan sebagai piawaian emas untuk kuantifikasi asid nukleik; kaedah langsung dan oleh itu mudah dan cepat mengukur penyerapan sampel pada 260 nm, dan kepekatan dikira dengan bantuan faktor penukaran.
Jika kepekatan DNA adalah sangat rendah, walau bagaimanapun (< 1 µg/mL dsDNA), atau jika ia tercemar dengan bahan yang turut menyerap dalam julat 260 nm (cth RNA, protein, garam), kaedah ini akan mencapai hadnya. Dalam kes kepekatan yang sangat rendah, bacaan tidak lama lagi akan menjadi terlalu tidak tepat untuk digunakan, dan pencemaran akan membawa kepada (kadang-kadang besar) terlalu tinggi nilai sebenar. Dalam kes ini, kuantifikasi menggunakan pendarfluor mungkin memberikan alternatif. Teknik ini berdasarkan penggunaan pewarna pendarfluor yang mengikat secara khusus kepada dsDNA hanya kompleks yang terdiri daripada asid nukleik dan pewarna yang teruja oleh cahaya, dan ia kemudiannya akan memancarkan cahaya dengan panjang gelombang yang lebih tinggi sedikit. Di sini, keamatan isyarat pendarfluor adalah berkadar dengan jumlah DNA, dan untuk menentukan kepekatan ia dinilai berhubung dengan lengkung piawai. Kelebihan kaedah ini terletak pada kekhususan ikatan, yang tidak termasuk pengaruh luaran yang diperkenalkan oleh pencemaran, serta pada keupayaan yang terhasil untuk mengesan kepekatan DNA yang sangat rendah. Kesesuaian mana-mana kaedah bergantung terutamanya pada kepekatan dan ketulenan sampel; dalam kebanyakan kes, ia mungkin dinasihatkan untuk menggunakan kedua-dua kaedah secara selari.
Masa siaran: Nov-30-2022