पीसीआर मिश्रण पाइपेटिंग करताना काय विचारात घ्यावे?

यशस्वी प्रवर्धनाच्या प्रतिक्रियांसाठी, प्रत्येक तयारीमध्ये वैयक्तिक प्रतिक्रिया घटक योग्य एकाग्रतेमध्ये असणे आवश्यक आहे. याव्यतिरिक्त, हे महत्वाचे आहे की कोणतेही दूषितपणा उद्भवत नाही.

विशेषत: जेव्हा बर्‍याच प्रतिक्रिया सेट अप कराव्या लागतात, तेव्हा प्रत्येक जहाजात प्रत्येक अभिकर्मक स्वतंत्रपणे पाइपेट करण्याऐवजी तथाकथित मास्टर मिक्स तयार करण्यासाठी स्थापित केले गेले आहे. पूर्व-कॉन्फिगर केलेले मिक्स व्यावसायिकपणे उपलब्ध आहेत, ज्यामध्ये केवळ नमुना-विशिष्ट घटक (प्राइमर) आणि पाणी जोडले जाते. वैकल्पिकरित्या, मास्टर मिक्स स्वतः तयार केले जाऊ शकते. दोन्ही रूपांमध्ये, मिश्रण प्रत्येक पीसीआर पात्रात टेम्पलेटशिवाय वितरित केले जाते आणि शेवटी स्वतंत्र डीएनए नमुना स्वतंत्रपणे जोडला जातो.

मास्टर मिक्स वापरण्याचे अनेक फायदे आहेत: प्रथम, एकल पाइपेटिंग चरणांची संख्या कमी केली जाते. अशाप्रकारे, पाइपेटिंग दरम्यान वापरकर्त्याच्या त्रुटींचा धोका आणि दूषित होण्याचा धोका कमी केला जातो आणि अर्थातच वेळ वाचविला जातो. तत्वतः, पाइपेटिंग अचूकता देखील जास्त आहे, कारण मोठ्या प्रमाणात डोस केले जातात. पाइपेट्सचा तांत्रिक डेटा तपासताना हे समजणे सोपे आहे: डोस केलेले व्हॉल्यूम जितके लहान असेल तितके विचलन जास्त असू शकते. सर्व तयारी एकाच पात्रातून येतात या वस्तुस्थितीचा एकसमानतेवर सकारात्मक परिणाम होतो (जर चांगले मिसळले असेल तर). यामुळे प्रयोगांची पुनरुत्पादकता देखील सुधारते.

मास्टर मिक्स तयार करताना, कमीतकमी 10 % अतिरिक्त व्हॉल्यूम जोडला जावा (उदा. 10 तयारी आवश्यक असल्यास, 11 च्या आधारावर गणना करा), जेणेकरून शेवटचे जहाज देखील योग्यरित्या भरले जाईल. अशाप्रकारे, (किंचित) चुकीच्या गोष्टी आणि डिटर्जंट-युक्त समाधानाची भरपाई केली जाऊ शकते. डिटर्जंट्स पॉलिमेरेसेस आणि मास्टर मिक्स सारख्या सजीवांच्या शरीरात निर्मार्ण होणारे द्रव्य सोल्यूशन्समध्ये असतात, ज्यामुळे फोम तयार होणे आणि सामान्यच्या आतील पृष्ठभागावर अवशेष उद्भवतातपिपेट टिप्स.

अनुप्रयोग आणि वितरित करण्यासाठी द्रव प्रकारानुसार, योग्य पाइपेटिंग तंत्र (1) निवडले जावे आणि योग्य उपकरणे निवडली पाहिजेत. डिटर्जंट्स असलेल्या सोल्यूशन्ससाठी, थेट विस्थापन प्रणाली किंवा एअर-कुशन पाइपेट्सचा पर्याय म्हणून तथाकथित “कमी धारणा” पिपेट टिप्सची शिफारस केली जाते. चा प्रभावनिपुण पिपेट टीपविशेषतः हायड्रोफोबिक पृष्ठभागावर आधारित आहे. डिटर्जंट्स असलेले द्रव आत आणि बाहेरील अवशेष फिल्म सोडत नाहीत, जेणेकरून समाधान कमी होणे कमी केले जाऊ शकते.

सर्व घटकांच्या अचूक डोस व्यतिरिक्त, तयारीचे कोणतेही दूषित होणे देखील महत्वाचे आहे. उच्च शुद्धतेच्या उपभोग्य वस्तूंचा वापर करणे पुरेसे नाही, कारण एअर कुशन पिपेटमधील पाइपेटिंग प्रक्रिया पिपेटमध्ये राहिलेल्या एरोसोल तयार करू शकते. एरोसोलमध्ये समाविष्ट असलेल्या डीएनए खालील पाइपेटिंग चरणात एका नमुन्यातून दुसर्‍या नमुन्यात हस्तांतरित केले जाऊ शकते आणि त्यामुळे दूषित होण्यास कारणीभूत ठरते. वर नमूद केलेल्या थेट विस्थापन प्रणाली देखील हा धोका कमी करू शकतात. एअर-कुशन पाइपेट्ससाठी स्प्लॅश, एरोसोल आणि बायोमोलिक्यूलस टिकवून ठेवून पिपेट शंकूचे संरक्षण करण्यासाठी फिल्टर टिप्स वापरणे अर्थपूर्ण आहे.