न्यूक्लिक ॲसिड एक्सट्रॅक्शन आणि मॅग्नेटिक बीड पद्धत

परिचय

न्यूक्लिक ॲसिड एक्सट्रॅक्शन म्हणजे काय?

अगदी सोप्या भाषेत, न्यूक्लिक ॲसिड काढणे म्हणजे नमुन्यातून आरएनए आणि/किंवा डीएनए काढून टाकणे आणि आवश्यक नसलेले सर्व अतिरिक्त. काढण्याची प्रक्रिया नमुन्यातील न्यूक्लिक ॲसिड वेगळे करते आणि त्यांना एकाग्र इल्युएटच्या रूपात मिळते, कोणत्याही डाउनस्ट्रीम ऍप्लिकेशन्सवर परिणाम करू शकणारे सौम्य आणि दूषित पदार्थांपासून मुक्त होते.

न्यूक्लिक ॲसिड एक्सट्रॅक्शनचे ऍप्लिकेशन्स

प्युरिफाईड न्यूक्लिक ॲसिडचा वापर अनेक वेगवेगळ्या उद्योगांमध्ये विविध ऍप्लिकेशन्समध्ये केला जातो. हेल्थकेअर हे कदाचित ते क्षेत्र आहे जिथे ते सर्वात जास्त वापरले जाते, विविध चाचणी उद्देशांसाठी शुद्ध केलेले आरएनए आणि डीएनए आवश्यक आहे.

हेल्थकेअरमध्ये न्यूक्लिक ॲसिड काढण्याच्या अनुप्रयोगांमध्ये हे समाविष्ट आहे:

- पीसीआर आणि क्यूपीसीआर प्रवर्धन

- नेक्स्ट जनरेशन सिक्वेन्सिंग (NGS)

- प्रवर्धन-आधारित SNP जीनोटाइपिंग

- ॲरे-आधारित जीनोटाइपिंग

- निर्बंध एन्झाइम पचन

- मॉडिफायिंग एन्झाईम्स (उदा. लिगेशन आणि क्लोनिंग) वापरून विश्लेषण

हेल्थकेअरच्या पलीकडे इतर फील्ड देखील आहेत जेथे न्यूक्लिक ॲसिड काढण्याचा वापर केला जातो, ज्यामध्ये पितृत्व चाचणी, फॉरेन्सिक्स आणि जीनोमिक्सचा समावेश आहे परंतु ते मर्यादित नाही.

न्यूक्लिक ॲसिड काढण्याचा संक्षिप्त इतिहास

डीएनए काढणे1869 मध्ये फ्रेडरिक मिशर नावाच्या स्विस वैद्याने प्रथम ज्ञात पृथक्करण केले होते. मिशेरला पेशींची रासायनिक रचना ठरवून जीवनाची मूलभूत तत्त्वे सोडवण्याची आशा होती. लिम्फोसाइट्समध्ये अयशस्वी झाल्यानंतर, तो टाकून दिलेल्या पट्ट्यांवर पूमध्ये सापडलेल्या ल्युकोसाइट्समधून डीएनएचा क्रूड अवक्षेपण मिळवू शकला. त्याने सेलच्या सायटोप्लाझममधून बाहेर पडण्यासाठी पेशीमध्ये ऍसिड आणि नंतर अल्कली जोडून हे केले आणि नंतर डीएनएला इतर प्रथिनांपासून वेगळे करण्यासाठी प्रोटोकॉल विकसित केला.

मिशेरच्या अभूतपूर्व संशोधनानंतर, इतर अनेक शास्त्रज्ञांनी डीएनए वेगळे आणि शुद्ध करण्याचे तंत्र विकसित केले आहे. एडविन जोसेफ कोह्न, प्रथिने शास्त्रज्ञ यांनी दुसऱ्या महायुद्धात प्रथिने शुद्धीकरणासाठी अनेक तंत्रे विकसित केली. रक्ताच्या प्लाझ्माच्या सीरम अल्ब्युमिन अंशाला वेगळे करण्यासाठी तो जबाबदार होता, जो रक्तवाहिन्यांमधील ऑस्मोटिक दाब राखण्यासाठी महत्त्वपूर्ण आहे. सैनिकांना जिवंत ठेवण्यासाठी हे महत्त्वाचे होते.

1953 मध्ये फ्रान्सिस क्रिक यांनी रोझलिंड फ्रँकलिन आणि जेम्स वॉटसन यांच्यासमवेत DNA ची रचना निश्चित केली, जे दर्शविते की ते न्यूक्लिक ॲसिड न्यूक्लियोटाइड्सच्या दोन लांब साखळ्यांनी बनलेले आहे. या यशस्वी शोधामुळे मेसेल्सन आणि स्टॅहल यांच्यासाठी मार्ग मोकळा झाला, ज्यांनी त्यांच्या 1958 च्या प्रयोगादरम्यान डीएनएची अर्ध-पुराणमतवादी प्रतिकृती प्रदर्शित केल्यामुळे ई. कोली जीवाणूपासून डीएनए वेगळे करण्यासाठी घनता ग्रेडियंट सेंट्रीफ्यूगेशन प्रोटोकॉल विकसित करण्यात सक्षम होते.

न्यूक्लिक ॲसिड काढण्याचे तंत्र

डीएनए काढण्याचे 4 टप्पे काय आहेत?
सर्व निष्कर्षण पद्धती समान मूलभूत चरणांवर उकळतात.

सेल व्यत्यय. या अवस्थेमध्ये, ज्याला सेल लिसिस देखील म्हणतात, त्यात पेशीची भिंत आणि/किंवा सेल झिल्ली तोडणे समाविष्ट असते, ज्यामुळे इंट्रा-सेल्युलर द्रवपदार्थ बाहेर पडतात ज्यामध्ये न्यूक्लिक ॲसिड असतात.

अवांछित मोडतोड काढणे. यामध्ये मेम्ब्रेन लिपिड, प्रथिने आणि इतर अवांछित न्यूक्लिक ॲसिड समाविष्ट आहेत जे डाउनस्ट्रीम ऍप्लिकेशन्समध्ये व्यत्यय आणू शकतात.

अलगीकरण. तुम्ही तयार केलेल्या क्लीअर केलेल्या लायसेटमधून स्वारस्य असलेले न्यूक्लिक ॲसिड वेगळे करण्याचे अनेक मार्ग आहेत, जे दोन मुख्य श्रेणींमध्ये येतात: सोल्यूशन आधारित किंवा घन स्थिती (पुढील विभाग पहा).

एकाग्रता. न्यूक्लिक ॲसिड इतर सर्व दूषित पदार्थ आणि पातळ पदार्थांपासून वेगळे केल्यानंतर, ते उच्च-केंद्रित एल्युएटमध्ये सादर केले जातात.

काढण्याचे दोन प्रकार
न्यूक्लिक ॲसिड काढण्याचे दोन प्रकार आहेत - सोल्युशन आधारित पद्धती आणि सॉलिड स्टेट पद्धती. सोल्युशनवर आधारित पद्धतीला रासायनिक निष्कर्षण पद्धत म्हणून देखील ओळखले जाते, कारण त्यात सेल तोडण्यासाठी आणि न्यूक्लिक सामग्रीमध्ये प्रवेश करण्यासाठी रसायनांचा वापर करणे समाविष्ट आहे. हे एकतर सेंद्रिय संयुगे जसे की फिनॉल आणि क्लोरोफॉर्म किंवा कमी हानिकारक आणि म्हणून अधिक शिफारस केलेले अकार्बनिक संयुगे जसे की प्रोटीनेज के किंवा सिलिका जेल वापरत असू शकते.

सेल तोडण्यासाठी विविध रासायनिक निष्कर्षण पद्धतींच्या उदाहरणांमध्ये हे समाविष्ट आहे:

- झिल्लीचे ऑस्मोटिक फाटणे

- सेल भिंत च्या enzymatic पचन

- झिल्लीचे विद्राव्यीकरण

- डिटर्जंटसह

- अल्कली उपचार सह

सॉलिड स्टेट तंत्र, ज्याला यांत्रिक पद्धती देखील म्हणतात, त्यात डीएनए घन सब्सट्रेटशी कसा संवाद साधतो याचे शोषण समाविष्ट आहे. एक मणी किंवा रेणू निवडून ज्यावर डीएनए बांधील परंतु विश्लेषक करणार नाही, दोन्ही वेगळे करणे शक्य आहे. सिलिका आणि चुंबकीय मणी वापरण्यासह सॉलिड-फेज एक्सट्रॅक्शन तंत्रांची उदाहरणे.

चुंबकीय मणी निष्कर्षण स्पष्ट केले

चुंबकीय मणी काढण्याची पद्धत
व्हाईटहेड इन्स्टिट्यूट संशोधन संस्थेसाठी ट्रेव्हर हॉकिन्सने दाखल केलेल्या यूएस पेटंटमध्ये चुंबकीय मणी वापरून काढण्याची क्षमता प्रथम ओळखली गेली. या पेटंटने कबूल केले की अनुवांशिक सामग्री त्यांना घन आधार वाहकाशी बांधून काढणे शक्य आहे, जे चुंबकीय मणी असू शकते. तत्त्व असे आहे की तुम्ही उच्च कार्यक्षम चुंबकीय मणी वापरता ज्यावर अनुवांशिक सामग्री बांधली जाईल, जे नंतर नमुना धारण केलेल्या जहाजाच्या बाहेरील बाजूस चुंबकीय शक्ती लागू करून सुपरनॅटंटपासून वेगळे केले जाऊ शकते.

चुंबकीय मणी निष्कर्षण का वापरावे?
चुंबकीय मणी काढण्याचे तंत्रज्ञान अधिकाधिक प्रचलित होत आहे, ते जलद आणि कार्यक्षम निष्कर्षण प्रक्रियेसाठी असलेल्या संभाव्यतेमुळे. अलिकडच्या काळात योग्य बफर सिस्टीमसह उच्च कार्यक्षम चुंबकीय मणी विकसित झाल्या आहेत, ज्यामुळे न्यूक्लिक ॲसिड काढण्याचे ऑटोमेशन शक्य झाले आहे आणि वर्कफ्लो अतिशय कमी आणि किफायतशीर आहे. तसेच, चुंबकीय मणी काढण्याच्या पद्धतींमध्ये सेंट्रीफ्यूगेशन पायऱ्यांचा समावेश नसतो ज्यामुळे कातरणे बल होऊ शकते ज्यामुळे डीएनएचे लांब तुकडे फुटतात. याचा अर्थ असा की डीएनएचे लांब पट्टे अबाधित राहतात, जे जीनोमिक्स चाचणीमध्ये महत्त्वाचे आहे.