माझ्या पीसीआर प्रतिक्रियेत आपण किती टेम्पलेट जोडावे?

जरी सिद्धांतानुसार, टेम्पलेटचे एक रेणू पुरेसे असेल, बहुतेक डीएनए मोठ्या प्रमाणात क्लासिक पीसीआरसाठी वापरले जातात, उदाहरणार्थ, जीनोमिक स्तनपायी डीएनएच्या 1 µg पर्यंत आणि 1 पीजी प्लाझ्मिड डीएनए पर्यंत. इष्टतम रक्कम मुख्यत्वे लक्ष्य अनुक्रमांच्या प्रतींच्या संख्येवर तसेच त्याच्या जटिलतेवर अवलंबून असते.

जर फारच कमी टेम्पलेट वापरली गेली असेल तर, पुरेसे उत्पादन मिळविण्यासाठी एम्प्लिफिकेशन चक्रांच्या संख्येत संबंधित वाढ आवश्यक आहे. बहुतेक पीसीआर प्रयोगांसाठी वापरल्या जाणार्‍या टीएक्यू पॉलिमरेजमध्ये सुधार कार्य (3′-5 ′ एक्सोन्यूक्लीझ क्रियाकलाप) वैशिष्ट्यीकृत नसते; अशा प्रकारे, प्रवर्धन दरम्यान उद्भवणार्‍या त्रुटी दुरुस्त केल्या जाऊ शकत नाहीत. चक्रांची संख्या जितकी जास्त असेल तितकी सदोष उत्पादनाचे प्रवर्धन अधिक प्रचलित असेल. दुसरीकडे, टेम्पलेटची मात्रा खूपच जास्त असल्यास, प्राइमर इतर (शंभर टक्के प्रशंसाकारक नाही) अनुक्रम, तसेच प्राइमर डायमर तयार करण्याची शक्यता वाढेल, ज्यामुळे वाढेल, ज्यामुळे वाढ होईल उप-उत्पादने. बर्‍याच प्रकरणांमध्ये, डीएनए सेल संस्कृतीतून किंवा सूक्ष्मजीवांपासून वेगळे केले जाते आणि त्यानंतर पीसीआर टेम्पलेट म्हणून वापरले जाते. शुद्धीकरणानंतर, पीसीआर सेटअपसाठी आवश्यक असलेले व्हॉल्यूम परिभाषित करण्यास सक्षम होण्यासाठी डीएनएची एकाग्रता निश्चित करणे आवश्यक आहे. अ‍ॅगरोस जेल इलेक्ट्रोफोरेसीसचा अंदाज प्रदान केला जाऊ शकतो, परंतु ही पद्धत अचूक आहे. न्यूक्लिक ids सिडच्या प्रमाणीकरणासाठी सोन्याचे मानक म्हणून अतिनील-व्हिज स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रीची स्थापना केली गेली आहे; हे थेट आणि म्हणून सोपे आणि द्रुत पद्धतीचे उपाय 260 एनएमच्या नमुन्याचे शोषण करतात आणि रूपांतरण घटकाच्या मदतीने एकाग्रतेची गणना केली जाते.

जर डीएनए एकाग्रता खूपच कमी असेल तर (<1 µg/एमएल डीएसडीएनए) किंवा जर ते 260 एनएम श्रेणीमध्ये (उदा. आरएनए, प्रथिने, लवण) देखील शोषून घेणार्‍या पदार्थांनी दूषित असेल तर ही पद्धत त्याच्या मर्यादांपर्यंत पोहोचेल. अगदी कमी एकाग्रतेच्या बाबतीत, वाचन लवकरच वापरण्यासाठी खूपच चुकीचे होईल आणि दूषित पदार्थांमुळे वास्तविक मूल्याचे (कधीकधी प्रचंड) जास्त महत्त्व दिले जाईल. या प्रकरणात, फ्लूरोसेंस वापरुन क्वांटिफिकेशन एक पर्यायी सादर करू शकते. हे तंत्र फ्लूरोसंट डाईच्या वापरावर आधारित आहे जे विशेषत: डीएसडीएनएशी बांधले जाते केवळ न्यूक्लिक acid सिड आणि डाई असलेले जटिल प्रकाशामुळे उत्साही होते आणि त्यानंतर ते किंचित जास्त तरंगलांबीचा प्रकाश उत्सर्जित करेल. येथे, फ्लोरोसेंट सिग्नलची तीव्रता डीएनएच्या प्रमाणात प्रमाणित आहे आणि एकाग्रता निश्चित करण्यासाठी त्याचे मूल्यांकन मानक वक्रांच्या संबंधात केले जाते. या पद्धतीचे फायदे बॉन्डच्या विशिष्टतेवर विश्रांती घेतात, जे दूषिततेद्वारे सादर केलेल्या बाह्य प्रभावांना तसेच डीएनएची अत्यंत कमी सांद्रता शोधण्याच्या परिणामी क्षमतेवर वगळते. कोणत्याही पद्धतीची योग्यता प्रामुख्याने नमुना एकाग्रता आणि शुद्धतेवर अवलंबून असते; बर्‍याच प्रकरणांमध्ये समांतर दोन्ही पद्धती लागू करण्याचा सल्ला दिला जाऊ शकतो.