माझ्या पीसीआर प्रतिक्रियेमध्ये आम्ही किती टेम्पलेट जोडले पाहिजे?

जरी सिद्धांतानुसार, टेम्प्लेटचा एक रेणू पुरेसा असेल, तरीही सामान्यतः क्लासिक पीसीआरसाठी मोठ्या प्रमाणात DNA वापरले जातात, उदाहरणार्थ, 1 µg पर्यंत जीनोमिक सस्तन DNA आणि 1 pg प्लास्मिड DNA. इष्टतम रक्कम मुख्यत्वे लक्ष्य क्रमाच्या प्रतींच्या संख्येवर तसेच त्याच्या जटिलतेवर अवलंबून असते.

जर फारच कमी टेम्प्लेट वापरले असेल, तर पुरेशा प्रमाणात उत्पादन मिळविण्यासाठी प्रवर्धन चक्रांच्या संख्येत संबंधित वाढ आवश्यक असेल. बहुतेक पीसीआर प्रयोगांसाठी वापरल्या जाणाऱ्या Taq पॉलिमरेजमध्ये सुधारणा कार्य (3′-5′ exonuclease क्रियाकलाप) वैशिष्ट्यीकृत नाही; अशा प्रकारे, प्रवर्धनादरम्यान होणाऱ्या चुका दुरुस्त केल्या जाऊ शकत नाहीत. चक्रांची संख्या जितकी जास्त असेल तितके दोषपूर्ण उत्पादनाचे प्रवर्धन अधिक प्रचलित असेल. दुसरीकडे, जर, टेम्पलेटचे प्रमाण खूप जास्त असेल, तर इतर (शंभर टक्के पूरक नाही) अनुक्रमांमध्ये प्राइमर्स ॲनिलिंग होण्याची शक्यता, तसेच प्राइमर डायमर्सची निर्मिती वाढेल, ज्यामुळे वाढ होईल. उप-उत्पादने. अनेक प्रकरणांमध्ये, डीएनए सेल कल्चर किंवा सूक्ष्मजीवांपासून वेगळे केले जाते आणि नंतर पीसीआर टेम्पलेट म्हणून वापरले जाते. शुद्धीकरणानंतर, पीसीआर सेटअपसाठी आवश्यक असलेल्या व्हॉल्यूमची व्याख्या करण्यास सक्षम होण्यासाठी डीएनएची एकाग्रता निश्चित करणे आवश्यक आहे. ॲग्रोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसीस अंदाज प्रदान करू शकते, ही पद्धत अचूक नाही. यूव्ही-व्हिस स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री हे न्यूक्लिक ॲसिडचे प्रमाण निश्चित करण्यासाठी सुवर्ण मानक म्हणून स्थापित केले गेले आहे; ही थेट आणि म्हणून सोपी आणि जलद पद्धत 260 nm वर नमुन्याचे शोषण मोजते आणि एकाग्रता रूपांतरण घटकाच्या मदतीने मोजली जाते.

जर डीएनए एकाग्रता खूपच कमी असेल, तथापि (< 1 µg/mL dsDNA), किंवा 260 nm श्रेणीमध्ये (उदा. RNA, प्रथिने, क्षार) शोषून घेणाऱ्या पदार्थांनी दूषित असल्यास, ही पद्धत त्याच्या मर्यादेपर्यंत पोहोचेल. अत्यंत कमी एकाग्रतेच्या बाबतीत, वाचन लवकरच वापरण्यासाठी खूप चुकीचे होईल आणि दूषिततेमुळे वास्तविक मूल्याचा (कधीकधी प्रचंड) जास्त अंदाज येईल. या प्रकरणात, फ्लोरोसेन्स वापरून परिमाण निश्चित करणे पर्यायी असू शकते. हे तंत्र फ्लोरोसेंट डाईच्या वापरावर आधारित आहे जे विशेषत: dsDNA ला जोडते फक्त न्यूक्लिक ॲसिड आणि डाई असलेले कॉम्प्लेक्स प्रकाशाने उत्तेजित होते आणि ते नंतर किंचित जास्त तरंगलांबीचा प्रकाश उत्सर्जित करेल. येथे, फ्लोरोसेंट सिग्नलची तीव्रता डीएनएच्या प्रमाणात असते आणि एकाग्रता निश्चित करण्यासाठी ते प्रमाणित वक्र संदर्भात मूल्यमापन केले जाते. या पद्धतीचे फायदे बाँडच्या विशिष्टतेवर अवलंबून असतात, जे दूषिततेमुळे निर्माण होणारे बाह्य प्रभाव वगळते, तसेच डीएनएची अत्यंत कमी सांद्रता शोधण्याच्या परिणामी क्षमतेवर अवलंबून असते. कोणत्याही पद्धतीची उपयुक्तता प्रामुख्याने नमुना एकाग्रता आणि शुद्धतेवर अवलंबून असते; बऱ्याच प्रकरणांमध्ये दोन्ही पद्धती समांतर लागू करण्याचा सल्ला दिला जाऊ शकतो.