Хэдийгээр онолын хувьд загварын нэг молекул хангалттай байх боловч сонгодог ПГУ-д ихэвчлэн илүү их хэмжээний ДНХ ашигладаг, жишээлбэл, 1 мкг геномын хөхтөн амьтдын ДНХ, 1 pg плазмидын ДНХ хүртэл. Хамгийн оновчтой хэмжээ нь зорилтот дарааллын хуулбарын тоо, түүнчлэн нарийн төвөгтэй байдлаас ихээхэн хамаардаг.
Хэрэв маш бага загвар ашигласан бол хангалттай хэмжээний бүтээгдэхүүн авахын тулд олшруулах циклийн тоог зохих хэмжээгээр нэмэгдүүлэх шаардлагатай болно. Ихэнх ПГУ-ын туршилтанд ашигладаг Taq полимераз нь залруулгын функцийг агуулдаггүй (3′-5′ экзонуклеазын идэвхжил); Тиймээс олшруулах явцад гарсан алдааг засах боломжгүй. Циклийн тоо их байх тусам алдаатай бүтээгдэхүүнийг олшруулах нь илүү их тархах болно. Хэрэв нөгөө талаас, загварын хэмжээ хэт өндөр байвал праймерууд бусад (зуун хувь нэмэлт биш) дараалалд шилжих, түүнчлэн праймер димер үүсэх магадлал нэмэгдэж, энэ нь олшроход хүргэдэг. дайвар бүтээгдэхүүн. Ихэнх тохиолдолд ДНХ-ийг эсийн өсгөвөр эсвэл бичил биетнээс тусгаарлаж, дараа нь ПГУ-ын загвар болгон ашигладаг. Цэвэршүүлсний дараа ПГУ-ын тохиргоонд шаардагдах эзлэхүүнийг тодорхойлохын тулд ДНХ-ийн концентрацийг тодорхойлох шаардлагатай. Агароз гель электрофорез нь тооцоолол хийх боломжтой боловч энэ арга нь үнэн зөв биш юм. Хэт ягаан туяаны-Vis спектрофотометрийг нуклейн хүчлийн хэмжээг тодорхойлох алтан стандарт гэж тогтоосон; Энэхүү шууд, тиймээс хялбар бөгөөд хурдан арга нь дээжийн шингээлтийг 260 нм-д хэмжиж, концентрацийг хувиргах коэффициентийн тусламжтайгаар тооцдог.
Хэрэв ДНХ-ийн концентраци маш бага (<1 мкг/мл dsDNA) эсвэл 260 нм-ийн мужид шингэдэг бодисоор (жишээ нь, РНХ, уураг, давс) бохирдсон бол энэ арга нь хязгаартаа хүрнэ. Маш бага концентрацитай тохиолдолд уншилтууд нь удалгүй ашиглахад хэтэрхий буруу болж, бохирдол нь бодит утгыг (заримдаа асар их) хэт үнэлэхэд хүргэдэг. Энэ тохиолдолд флюресцент ашиглан хэмжилт хийх нь өөр хувилбар байж болно. Энэ техник нь dsDNA-тай тусгайлан холбогддог флюресцент будаг хэрэглэхэд суурилдаг бөгөөд зөвхөн нуклейн хүчил, будагч бодисоос бүрдэх цогцолбор нь гэрлээр өдөөгдөж, улмаар бага зэрэг өндөр долгионы урттай гэрлийг ялгаруулдаг. Энд флюресцент дохионы эрч хүч нь ДНХ-ийн хэмжээтэй пропорциональ бөгөөд концентрацийг тодорхойлохдоо стандарт муруйтай уялдуулан үнэлдэг. Энэ аргын давуу тал нь бохирдлоос үүдэлтэй гадны нөлөөллөөс хамаарахгүй холболтын өвөрмөц чанар, түүнчлэн ДНХ-ийн маш бага концентрацийг илрүүлэх чадварт тулгуурладаг. Аль ч аргын тохиромжтой байдал нь дээжийн концентраци болон цэвэршилтээс ихээхэн хамаардаг; ихэнх тохиолдолд хоёр аргыг зэрэгцүүлэн хэрэглэх нь зүйтэй.
Шуудангийн цаг: 2022 оны 11-р сарын 30-ны хооронд