എന്റെ പിസിആർ പ്രതികരണത്തിൽ നാം എത്ര ടെംപ്ലേറ്റ് എത്രമാത്രം ചേർക്കണം?

സിദ്ധാന്തത്തിൽ, ടെംപ്ലേറ്റിന്റെ ഒരു തന്മാത്ര മതിയാകും, വളരെ വലുതായി ഒരു ക്ലാസിക് പിസിആറിനായി സാധാരണയായി ഉപയോഗിക്കുന്നു, ഉദാഹരണത്തിന്, 1 μ ഗ്രാം മുതൽ കാൻമസിക് മമ്മോമിക് മമ്മോമിക് ഡിഎൻഎ വരെ. ഒപ്റ്റിമൽ തുക വലിയ തോതിൽ ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസ് പകർപ്പുകളുടെ എണ്ണത്തെയും അതിന്റെ സങ്കീർണ്ണതയെയും ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു.

വളരെ കുറച്ച് ടെംപ്ലേറ്റ് ഉപയോഗിക്കുകയാണെങ്കിൽ, മതിയായ ഉൽപ്പന്നം ലഭിക്കുന്നതിന് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ സൈക്കിളുകളുടെ എണ്ണത്തിൽ അനുബന്ധ വർദ്ധനവ് ആവശ്യമാണ്. മിക്ക പിസിആർ പരീക്ഷണങ്ങൾക്കും ഉപയോഗിക്കുന്ന ഒരു ടാക് പോളിമറേസ് ഒരു തിരുത്തൽ പ്രവർത്തനം (3'-5 'എക്സോനുക്ലേസിസ് പ്രവർത്തനം) അവതരിപ്പിക്കുന്നു; അതിനാൽ, ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ സമയത്ത് സംഭവിക്കുന്ന പിശകുകൾ ശരിയാക്കാൻ കഴിയില്ല. ചോദിക്കുക മറുവശത്ത്, ടെംപ്ലേറ്റിന്റെ അളവ് വളരെ കൂടുതലാണെങ്കിൽ, പ്രൈമർമാരുടെ സാധ്യത, പ്രൈമർമാരുടെ സാധ്യത, അതുപോലെ തന്നെ, അതുപോലെ തന്നെ പ്രൈമർ ദി മഷികളുടെ രൂപവത്കരണവും വർദ്ധിക്കും, ഇത് ആംപ്ലിഫിക്കേഷന് കാരണമാകും ഉപോൽപ്പന്നങ്ങൾ. പല കേസുകളിലും, സെൽ സംസ്കാരങ്ങളിൽ നിന്നോ സൂക്ഷ്മാണുക്കളിൽ നിന്നും ഡിഎൻഎ ഒറ്റപ്പെട്ടതും പിന്നീട് ഒരു പിസിആർ ടെംപ്ലേറ്റായി ഉപയോഗിക്കുന്നതുമാണ്. പിസിആർ സജ്ജീകരണത്തിന് ആവശ്യമായ വോളിയം നിർവചിക്കാൻ ഡിഎൻഎയുടെ സാന്ദ്രത നിർണ്ണയിക്കേണ്ടത് ആവശ്യമാണ്. അഗരോസ് ജെൽ ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് ഒരു എസ്റ്റിമേറ്റ് നൽകാൻ സഹായിക്കും, ഈ രീതി കൃത്യതയില്ലാത്തതാണ്. ന്യൂക്ലിക് ആസിഡുകളുടെ അളവ് കാരണം യുവി-വിസ് സ്പെക്ട്രോഫോട്ടോമെട്രി സ്ഥാപിച്ചു; ഈ നേരിട്ടുള്ളതും അതിനാൽ എളുപ്പവും ദ്രുതവുമായ രീതി 260 എൻഎം 260 എൻഎം ആഗിരണം ചെയ്യുന്നു, ഒരു പരിവർത്തന ഘടകത്തിന്റെ സഹായത്തോടെ ഏകാഗ്രത കണക്കാക്കുന്നു.

ഡിഎൻഎ ഏകാഗ്രത വളരെ കുറവാണെങ്കിൽ, അല്ലെങ്കിൽ (<1 μg / ml dsdna), അല്ലെങ്കിൽ അത് 260 എൻഎം ശ്രേണിയിൽ മലിനമാകുകയാണെങ്കിൽ (ഉദാ. ആർഎൻഎ, പ്രോട്ടീൻ, ലവണങ്ങൾ), ഈ രീതി അതിന്റെ പരിമിതികളിൽ എത്തും. വളരെ കുറഞ്ഞ സാന്ദ്രതയുടെ കാര്യത്തിൽ, വായനകൾ ഉടൻ തന്നെ ഉപയോഗപ്രദമാകേണ്ടത് കൃത്യമല്ല, മലിനീകരണം യഥാർത്ഥ മൂല്യത്തിന്റെ അമിത മൂല്യത്തേക്കാൾ നയിക്കും. ഈ സാഹചര്യത്തിൽ, ഫ്ലൂമെറൻസ് ഉപയോഗിച്ചുള്ള അളവ് ഒരു ബദൽ അവതരിപ്പിക്കാം. ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ്, ചായം എന്നിവ അടങ്ങിയ സമുദായത്തിന് പ്രത്യേകമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്ന ഒരു ഫ്ലൂറസെന്റ് ഡൈ ഉപയോഗിച്ചാണ് ഈ രീതി. ഇത് നേരിയ തരംഗദൈർഘ്യത്തിന്റെ വെളിച്ചം പുറപ്പെടുവിക്കും. ഇവിടെ, ഫ്ലൂറസെന്റ് സിഗ്നലിന്റെ തീവ്രത ഡിഎൻഎയുടെ അളവിന് ആനുപാതികമാണ്, ഇത് ഒരു സാധാരണ വളവുമായി ബന്ധപ്പെട്ട് വിലയിരുത്തുന്നതിനും വിലയിരുത്തുന്നു. മലിനീകരണത്തിലൂടെ അവതരിപ്പിച്ച ബാഹ്യ സ്വാധീനങ്ങളെ ബാധിക്കുന്ന ബോണ്ടിന്റെ പ്രത്യേകതയെ ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു, അത് ഡിഎൻഎയുടെ വളരെ കുറഞ്ഞ സാന്ദ്രത കണ്ടെത്താനുള്ള ഫലമായി കാരണമാകുന്നു. ഒന്നുകിൽ രീതിയുടെ അനുയോജ്യത പ്രധാനമായും സാമ്പിൾ ഏകാഗ്രതയെയും വിശുദ്ധിയെ ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു; പല കേസുകളിലും സമാന്തരമായി രണ്ട് രീതികളും പ്രയോഗിക്കുന്നതിന് പോലും ഉചിതമായിരിക്കും.