എൻ്റെ PCR പ്രതികരണത്തിലേക്ക് എത്ര ടെംപ്ലേറ്റ് ചേർക്കണം?

സിദ്ധാന്തത്തിൽ, ടെംപ്ലേറ്റിൻ്റെ ഒരു തന്മാത്ര മതിയാകുമെങ്കിലും, ഒരു ക്ലാസിക് PCR-ന് സാധാരണയായി വലിയ അളവിലുള്ള ഡിഎൻഎ ഉപയോഗിക്കുന്നു, ഉദാഹരണത്തിന്, 1 μg വരെ ജനിതക സസ്തനി ഡിഎൻഎയും 1 പിജി പ്ലാസ്മിഡ് ഡിഎൻഎയും. ഒപ്റ്റിമൽ തുക ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസിൻറെ പകർപ്പുകളുടെ എണ്ണത്തെയും അതിൻ്റെ സങ്കീർണ്ണതയെയും ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു.

വളരെ കുറച്ച് ടെംപ്ലേറ്റാണ് ഉപയോഗിക്കുന്നതെങ്കിൽ, മതിയായ അളവിൽ ഉൽപ്പന്നം ലഭിക്കുന്നതിന് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ സൈക്കിളുകളുടെ എണ്ണത്തിൽ അനുബന്ധമായ വർദ്ധനവ് ആവശ്യമാണ്. മിക്ക PCR പരീക്ഷണങ്ങൾക്കും ഉപയോഗിക്കുന്ന ഒരു Taq പോളിമറേസ് ഒരു തിരുത്തൽ ഫംഗ്‌ഷൻ ഫീച്ചർ ചെയ്യുന്നില്ല (3′-5′ exonuclease പ്രവർത്തനം); അതിനാൽ, ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ സമയത്ത് സംഭവിക്കുന്ന പിശകുകൾ തിരുത്താൻ കഴിയില്ല. സൈക്കിളുകളുടെ എണ്ണം കൂടുന്തോറും വികലമായ ഉൽപ്പന്നത്തിൻ്റെ വർദ്ധന കൂടുതൽ വ്യാപകമാകും. മറുവശത്ത്, ടെംപ്ലേറ്റിൻ്റെ അളവ് വളരെ കൂടുതലാണെങ്കിൽ, പ്രൈമറുകൾ മറ്റ് (നൂറു ശതമാനം കോംപ്ലിമെൻ്ററി അല്ല) സീക്വൻസുകളിലേക്കുള്ള അനീലിംഗ് പ്രോബബിലിറ്റിയും അതുപോലെ പ്രൈമർ ഡൈമറുകളുടെ രൂപീകരണവും വർദ്ധിക്കും, ഇത് വർദ്ധിപ്പിക്കും. ഉപോൽപ്പന്നങ്ങൾ. മിക്ക കേസുകളിലും, ഡിഎൻഎ കോശ സംസ്കാരങ്ങളിൽ നിന്നോ സൂക്ഷ്മാണുക്കളിൽ നിന്നോ വേർതിരിച്ചെടുക്കുകയും പിന്നീട് പിസിആർ ടെംപ്ലേറ്റായി ഉപയോഗിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു. ശുദ്ധീകരണത്തിന് ശേഷം, പിസിആർ സജ്ജീകരണത്തിന് ആവശ്യമായ വോളിയം നിർണ്ണയിക്കാൻ ഡിഎൻഎയുടെ സാന്ദ്രത നിർണ്ണയിക്കേണ്ടത് ആവശ്യമാണ്. അഗറോസ് ജെൽ ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് ഒരു എസ്റ്റിമേറ്റ് നൽകാൻ സഹായിക്കുമെങ്കിലും, ഈ രീതി കൃത്യമല്ല. UV-Vis സ്പെക്ട്രോഫോട്ടോമെട്രി ന്യൂക്ലിക് ആസിഡുകളുടെ അളവ് നിർണ്ണയിക്കുന്നതിനുള്ള സ്വർണ്ണ നിലവാരമായി സ്ഥാപിച്ചു; ഈ നേരിട്ടുള്ളതും അതിനാൽ എളുപ്പവും വേഗത്തിലുള്ളതുമായ രീതി 260 nm-ൽ സാമ്പിളിൻ്റെ ആഗിരണം അളക്കുന്നു, കൂടാതെ ഒരു പരിവർത്തന ഘടകത്തിൻ്റെ സഹായത്തോടെ ഏകാഗ്രത കണക്കാക്കുന്നു.

DNA സാന്ദ്രത വളരെ കുറവാണെങ്കിൽ, എന്നിരുന്നാലും (< 1 µg/mL dsDNA), അല്ലെങ്കിൽ 260 nm പരിധിയിൽ ആഗിരണം ചെയ്യുന്ന പദാർത്ഥങ്ങളാൽ മലിനമായാൽ (ഉദാ. RNA, പ്രോട്ടീൻ, ലവണങ്ങൾ), ഈ രീതി അതിൻ്റെ പരിമിതികളിൽ എത്തും. വളരെ കുറഞ്ഞ സാന്ദ്രതയുടെ കാര്യത്തിൽ, റീഡിംഗുകൾ ഉപയോഗിക്കാനാവാത്തവിധം കൃത്യമല്ലാത്തതായിത്തീരും, കൂടാതെ മലിനീകരണം യഥാർത്ഥ മൂല്യത്തിൻ്റെ (ചിലപ്പോൾ വലിയ) അമിതമായ വിലയിരുത്തലിലേക്ക് നയിക്കും. ഈ സാഹചര്യത്തിൽ, ഫ്ലൂറസെൻസ് ഉപയോഗിച്ചുള്ള അളവ് ഒരു ബദൽ അവതരിപ്പിച്ചേക്കാം. ന്യൂക്ലിക് ആസിഡും ഡൈയും ഉൾപ്പെടുന്ന സമുച്ചയം മാത്രം ഡിഎസ്ഡിഎൻഎയുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്ന ഫ്ലൂറസെൻ്റ് ഡൈയുടെ ഉപയോഗത്തെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ളതാണ് ഈ സാങ്കേതികത, അത് പിന്നീട് അൽപ്പം ഉയർന്ന തരംഗദൈർഘ്യമുള്ള പ്രകാശം പുറപ്പെടുവിക്കും. ഇവിടെ, ഫ്ലൂറസൻ്റ് സിഗ്നലിൻ്റെ തീവ്രത ഡിഎൻഎയുടെ അളവിന് ആനുപാതികമാണ്, കൂടാതെ സാന്ദ്രത നിർണ്ണയിക്കുന്നതിന് അത് ഒരു സാധാരണ വക്രവുമായി ബന്ധപ്പെട്ട് വിലയിരുത്തപ്പെടുന്നു. ഈ രീതിയുടെ ഗുണങ്ങൾ ബോണ്ടിൻ്റെ പ്രത്യേകതയെ ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു, ഇത് മലിനീകരണം മുഖേനയുള്ള ബാഹ്യ സ്വാധീനങ്ങളെ ഒഴിവാക്കുന്നു, അതുപോലെ തന്നെ ഡിഎൻഎയുടെ വളരെ കുറഞ്ഞ സാന്ദ്രത കണ്ടെത്താനുള്ള കഴിവും. ഏതെങ്കിലും രീതിയുടെ അനുയോജ്യത പ്രധാനമായും സാമ്പിൾ ഏകാഗ്രതയെയും ശുദ്ധതയെയും ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു; മിക്ക കേസുകളിലും രണ്ട് രീതികളും സമാന്തരമായി പ്രയോഗിക്കുന്നത് പോലും ഉചിതമാണ്.