Cryovialsнајчесто се користат за криогено складирање на клеточни линии и други критични биолошки материјали, во Dewars исполнети со течен азот.

Постојат неколку фази вклучени во успешното зачувување на клетките во течен азот. Додека основниот принцип е бавно замрзнување, точната техника користена зависи од типот на клетката и користениот криопротектант. Постојат неколку безбедносни размислувања и најдобри практики што треба да се земат предвид при складирање на клетки на толку ниски температури.

Овој пост има за цел да даде преглед на тоа како се чуваат криововите во течен азот.

Кои се Cryovials

Cryovials се мали, опфатени ампули дизајнирани за складирање на течни примероци на екстремно ниски температури. Тие обезбедуваат дека клетките зачувани во криопротектантот не доаѓаат во директен контакт со течниот азот, минимизирајќи го ризикот од клеточни фрактури, додека сè уште имаат корист од екстремниот ефект на ладење на течниот азот.

Вијалите обично се достапни во голем број на волумени и дизајни - тие можат да бидат внатрешно или надворешно навојни со рамни или заоблени дното. Стерилни и нестерилни формати се исто така достапни.

Кој користиКировијалиДа се ​​чуваат клетки во течен азот

Голем број на NHS и приватни лаборатории, како и истражувачки институции специјализирани за банкарство на крв, биологија на епителните клетки, имунологијата и биологијата на матични клетки користат криовијали во клетките на криопреверзи.

Клетките зачувани на овој начин вклучуваат Б и Т клетки, CHO клетки, хематопоетски матични и прогениторни клетки, хибридоми, цревни клетки, макрофаги, мезенхимални матични и прогениторни клетки, моноцити, миеломи, НК клетки и плурипотентни матични клетки.

Преглед на тоа како да се чуваат криовија во течен азот

Криопрезервацијата е процес што ги зачувува клетките и другите биолошки конструкции со тоа што ги лади на многу ниски температури. Клетките можат да се чуваат во течен азот со години без губење на одржливоста на клетките. Ова е преглед на користените процедури.

Подготовка на клетки

Точниот метод за подготовка на примероци ќе варира во зависност од типот на клетката, но во целина, клетките се собираат и центрифугираат за да развијат пелети богати со клетки. Оваа пелета потоа се суспендира во супернатантот измешан со криопротектант или медиум за криопрезервација.

Медиум за криопрезервација

Овој медиум се користи за зачувување на клетките во околините со ниска температура на кои ќе бидат подложени со инхибиција на формирање на интра и екстрацелуларни кристали и оттука смрт на клетките. Нивната улога е да обезбедат безбедна, заштитна околина за клетките и ткивата за време на процесите на замрзнување, складирање и топење.

Медиум, како што е свежа замрзната плазма (FFP), хепаринизиран раствор на плазмалит или раствори без серум, без компоненти, се меша со криопротектанти како што се диметил сулфоксид (DMSO) или глицерол.

Повторната пелета на примерокот е разоткриен во полипропиленски криовија, како што еСудски ас биомедицински компанија криогени складишта за складирање.

Важно е да не се преполнуваат криововите бидејќи тоа ќе го зголеми ризикот од пукање и можно ослободување на содржината (1).

Контролирана стапка на замрзнување

Во принцип, се користи бавно контролирана стапка на замрзнување за успешна криопрезервација на клетките.

Откако примероците се разгледуваат во криогени ампули, тие се поставени на влажен мраз или во 4 ℃ фрижидер и постапката за замрзнување се започнува во рок од 5 минути. Како генерален водич, клетките се ладат со брзина од -1 до -3 во минута (2). Ова се постигнува со употреба на програмабилен ладилник или со ставање ампули во изолирана кутија поставена во замрзнувач на контролирана стапка на –90 ° C.

Префрлување во течен азот

Замрзнатите криогени ампули потоа се пренесуваат во течен резервоар за азот за неопределени периоди, доколку се одржува температура помала од -135 ℃.

Овие ултра-ниски температури можат да се добијат со потопување во азот на течна или пареа фаза.

Течна или пареа фаза?

Складирањето во течна фаза азот е познато дека ја одржува студената температура со апсолутна конзистентност, но честопати не се препорачува од следниве причини:

• Потребата за големи количини (длабочина) на течен азот што е потенцијална опасност. Изгореници или асфиксија поради ова е вистински ризик.
• Документирани случаи на вкрстено загадување од заразни агенси како што се Аспергилус, Хеп Б и вирусно ширење преку течен азотниот медиум (2,3)
• Потенцијалот за течен азот да протекува во ампулите за време на потопување. Кога се отстранува од складирање и се загрева на собна температура, азотот брзо се шири. Како резултат на тоа, шишенцето може да се уништи кога се отстранува од течното складирање на азот, создавајќи опасност од остатоци од летање и изложеност на содржината (1, 4).

Од овие причини, ултра ниско складирање на температура е најчесто во азот на фаза на пареа. Кога примероците мора да се чуваат во течната фаза, треба да се користи специјализирана цевка за криофлекс.

Недостаток на фазата на пареа е дека може да се појави вертикален градиент на температура што резултира во температурни флуктуации помеѓу -135 ℃ и -190. Ова бара внимателно и вредно следење на нивото на течен азот и варијациите на температурата (5).

Многу производители препорачуваат криовиалите да бидат погодни за складирање до -135 ℃ или за употреба само во фазата на пареа.

Одмрзнување на вашите криопрезервирани клетки

Постапката за топење е стресна за замрзната култура и потребно е соодветно ракување и техника за да се обезбеди оптимална одржливост, закрепнување и функционалност на клетките. Точните протоколи за топење ќе зависат од специфичните типови клетки. Сепак, брзото топење се смета за стандардно за:

• Намалете го какво било влијание врз обновувањето на клетките
• Помогнете да го намалите времето на изложеност на растворите присутни во медиумите за замрзнување
• Минимизирајте ја каква било штета со рекристализација на мразот

Вода бањи, бањи со мушка или специјализирани автоматски инструменти најчесто се користат за топење на примероци.

Најчесто 1 клеточна линија е одмрзнато во време 1-2 минути, со нежно вртење во водена бања од 37 ℃, сè додека не остане само мал мраз во шишенцето пред да се измие во преовладуван медиум за раст.

За некои клетки како што се ембрионите на цицачи, бавното затоплување е од суштинско значење за нивниот опстанок.

Клетките сега се подготвени за клеточна култура, изолација на клетките или во случај на хематопоетски матични клетки - студии за одржливост за да се гарантира интегритетот на матичните клетки на донаторот пред миелоаблативната терапија.

Нормална практика е да се земат мали делови од преостанатиот примерок што се користи за извршување на броењето на клетките за да се утврдат концентрациите на клетките за позлата во културата. Потоа можете да ги процените резултатите од процедурите за изолација на клетките и да ја одредите одржливоста на клетките.

Најдобри практики за складирање на Cryovials

Успешната криопрезервација на примероците складирани во криовија, зависи од многу елементи во протоколот, вклучувајќи соодветно складирање и чување на евиденција.

• Поделени ќелии помеѓу локациите за складирање- Ако волуменот дозволи, разделете ги ќелиите помеѓу ампулите и чувајте ги на одделни локации за да го намалат ризикот од загуба на примерокот заради дефекти на опремата.
• Спречете вкрстено загадување-Одлучете се за стерилни криогени ампули со единечна употреба или автоклав пред последователна употреба
• Користете соодветно големина ампули за вашите клетки- ампулите доаѓаат во голем број на тома помеѓу 1 и 5мл. Избегнувајте преполнување ампули за да го намалите ризикот од пукање.
• Изберете внатрешни или надворешно навојни криогени ампули- Внатрешно навојни ампули се препорачуваат од страна на некои универзитети за безбедносни мерки - тие исто така можат да спречат загадување за време на полнење или кога се чуваат во течен азот.
• Спречи истекување-Користете дво-инјектирани заптивки, обликувани во капакот на завртката или О-прстените за да спречите протекување и загадување.
• Користете 2Д бар -кодови и ампули со етикета- За да се обезбеди следливост, ампулите со големи области за пишување овозможуваат секоја шишенце да биде соодветно обележана. 2Д баркодови можат да помогнат во управувањето со складирањето и водењето на евиденција. Капчињата кодирани во боја се корисни за полесно идентификување.
• Соодветно одржување на складирање- За да се обезбеди дека клетките не се изгубени, садовите за складирање постојано треба да го следат нивото на температурата и течниот азот. Алармите треба да бидат опремени за да ги предупредат корисниците на грешки.

Безбедносни мерки на претпазливост

Течниот азот стана вообичаена практика во современите истражувања, но носи ризик од сериозна повреда ако се користи неправилно.

Треба да се носи соодветна лична заштитна опрема (PPE) за да се минимизира ризикот од смрзнатини, изгореници и други неповолни инциденти при ракување со течен азот. Носат

• Криогени нараквици
• Лабораториски палто
• Отпорен на отпорен на целосен штит за лице што исто така го покрива вратот
• Чевли со затворен пети
• Пластична престилка од прскање

Течните азотни фрижидери треба да бидат поставени во добро проветрени области за да се минимизира ризикот од асфиксија-избегната азот испарува и го раселува атмосферскиот кислород. Продавниците со голем волумен треба да имаат системи за аларм со низок кислород.

Работата во парови при ракување со течен азот е идеално и треба да се забрани неговата употреба надвор од нормалното работно време.

Criovials за поддршка на вашиот работен тек

Компанијата за биомедикална компанија Suzhou ACE нуди широк избор на производи што ги задоволуваат вашите потреби за криопрезервација за различни типови клетки. Портфолиото вклучува голем број на цевки, како и низа стерилни криовија.

Нашите Cryovials се:

• Капа за завртки за лабораторија 0,5 мл 1,5 мл 2,0мл криогени криогени шишиња конусна дно критуб со заптивка со заптивка

  ● 0,5 мл, 1,5 мл, 2,0 мл спецификација, со здолниште или без здолниште
  ● Конусен или самостојно дизајнирање, стерилни или не-стерилни се и двете достапни
  ● Цевките за капаче за завртки се изработени од полипропилен од медицинска оценка
  ● PP Cryotube ампулите може постојано да се замрзнуваат и да се одмрзнат
  ● Надворешниот дизајн на капачето може да ја намали веројатноста за загадување за време на третманот со примероци.
  ● Криогени цевки со капаче за завртки Универзални навои за завртки за употреба
  ● Цевките се вклопуваат во најчестите ротори
  ● Криогени цевки со цевки О-прстен одговараат на стандардни 1-инчни и 2-инчни, 48Well, 81well ， 96well и 100Well Fempiner Boxes
  ● Автоклавенбилно до 121 ° C и замрзнување на -86 ° C

  Дел бр	Материјал	Волумен	КапаБоја	Компјутери/Торба	Торби/случај
  ACT05-BL-N	PP	0,5 мл	Црна, жолта, сина, црвена, виолетова, бела	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 мл	Црна, жолта, сина, црвена, виолетова, бела	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 мл	Црна, жолта, сина, црвена, виолетова, бела	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2.0ml	Црна, жолта, сина, црвена, виолетова, бела	500	10