Криовијаливообичаено се користат за криогенско складирање на клеточни линии и други критични биолошки материјали, во девари исполнети со течен азот.

Постојат неколку фази кои се вклучени во успешното зачувување на клетките во течен азот. Додека основниот принцип е бавно замрзнување, точната техника што се користи зависи од типот на клетката и употребениот криопротектор. Постојат неколку безбедносни размислувања и најдобри практики што треба да се земат предвид при складирање на ќелиите на толку ниски температури.

Овој пост има за цел да даде преглед на тоа како криовијалите се складираат во течен азот.

Што се криовијали

Криовијалите се мали ампули со капа наменети за складирање течни примероци на екстремно ниски температури. Тие обезбедуваат клетките зачувани во криопротектори да не дојдат во директен контакт со течниот азот, минимизирајќи го ризикот од клеточни фрактури додека сè уште имаат корист од екстремниот ефект на ладење на течниот азот.

Вијалите обично се достапни во голем број на волумени и дизајни - тие можат да бидат внатрешно или надворешно навојни со рамно или заоблено дно. Достапни се и стерилни и нестерилни формати.

Кој користиКировијализа складирање на клетките во течен азот

Низа NHS и приватни лаборатории, како и истражувачки институции специјализирани за банкарство на крв од папочна врвца, биологија на епителни клетки, имунологија и биологија на матични клетки користат криовијали за криопрезервирање на клетките.

Клетките зачувани на овој начин вклучуваат Б и Т-клетки, CHO клетки, хематопоетски матични и прогениторни клетки, хибридоми, цревни клетки, макрофаги, мезенхимални матични и прогениторни клетки, моноцити, миелом, NK клетки и плурипотентни матични клетки.

Преглед на тоа како да се чуваат криовијали во течен азот

Криопрезервацијата е процес кој ги зачувува клетките и другите биолошки конструкции со нивно ладење на многу ниски температури. Клетките може да се чуваат во течен азот со години без губење на одржливоста на клетките. Ова е преглед на процедурите кои се применуваат.

Подготовка на клетки

Точниот метод за подготовка на примероци ќе варира во зависност од типот на клетката, но генерално, клетките се собираат и се центрифугираат за да се развие пелети богата со клетки. Оваа пелета потоа повторно се суспендира во супернатантот измешан со криопротектор или медиум за криопрезервација.

Медиум за криопрезервација

Овој медиум се користи за зачувување на клетките во средини со ниски температури на кои ќе бидат подложени со инхибиција на формирањето на внатрешно и екстрацелуларни кристали, а со тоа и клеточна смрт. Нивната улога е да обезбедат безбедна, заштитна средина за клетките и ткивата за време на процесите на замрзнување, складирање и одмрзнување.

Медиум како што е свежо замрзната плазма (FFP), раствор на хепаринизиран плазмалит или раствори без серум, без животински компоненти, се меша со криопротектори како диметил сулфоксид (DMSO) или глицерол.

Повторниот ликвидиран примерок пелети се дели во полипропиленски криовијали како што сеБиомедицинска компанија Suzhou Ace Cryogenic Storage Vials.

Важно е да не се преполнуваат криовијалите бидејќи тоа ќе го зголеми ризикот од пукање и можно ослободување на содржината (1).

Контролирана стапка на замрзнување

Општо земено, бавна контролирана стапка на замрзнување се користи за успешна криопрезервација на клетките.

Откако примероците се делат во криогени ампули, тие се ставаат на влажен мраз или во фрижидер со температура од 4℃ и постапката за замрзнување започнува во рок од 5 минути. Како општ водич, ќелиите се ладат со брзина од -1 до -3 во минута (2). Ова се постигнува со помош на програмабилен ладилник или со ставање вијали во изолирана кутија сместена во замрзнувач со контролирана брзина од -70°C до -90°C.

Префрлете се во течен азот

Замрзнатите криогени ампули потоа се пренесуваат во резервоар со течен азот на неодредени периоди под услов да се одржува температура помала од -135℃.

Овие ултра ниски температури може да се добијат со потопување во азот во течна или пареа фаза.

Течна или пареа фаза?

Познато е дека складирањето во течна фаза азот ја одржува студената температура со апсолутна конзистентност, но често не се препорачува од следниве причини:

• Потребата од големи количини (длабочина) на течен азот што е потенцијална опасност. Изгорениците или задушувањето поради ова е реален ризик.
• Документирани случаи на вкрстена контаминација од инфективни агенси како што се аспергилус, хеп Б и вирусно ширење преку медиумот со течен азот (2,3)
• Потенцијалот за течен азот да истече во вијалите за време на потопувањето. Кога се отстранува од складирање и се загрева на собна температура, азотот брзо се шири. Следствено, вијалата може да се скрши кога ќе се извади од складиштето со течен азот, што создава опасност и од летечкиот отпад и од изложеноста на содржината (1, 4).

Поради овие причини, складирањето на ултра ниска температура најчесто се врши во азот од пареа фаза. Кога примероците мора да се складираат во течна фаза, треба да се користи специјализирана криофлекс цевка.

Негативната страна на фазата на пареа е тоа што може да се појави вертикален температурен градиент што резултира со температурни флуктуации помеѓу -135℃ и -190℃. Ова бара внимателно и вредно следење на нивоата на течен азот и температурните варијации (5).

Многу производители препорачуваат криовијалите да се погодни за складирање до -135℃ или само за употреба во фаза на пареа.

Одмрзнување на вашите криопрезервирани клетки

Постапката за одмрзнување е стресна за замрзната култура, а потребно е правилно ракување и техника за да се обезбеди оптимална одржливост, обновување и функционалност на клетките. Точните протоколи за одмрзнување ќе зависат од специфичните типови на клетки. Сепак, брзото одмрзнување се смета за стандардно за:

• Намалете го секое влијание врз клеточното закрепнување
• Помогнете да се намали времето на изложување на растворените материи присутни во медиумот за замрзнување
• Минимизирајте ги оштетувањата со рекристализација на мразот

За одмрзнување на примероците најчесто се користат водени бањи, бањи со монистра или специјализирани автоматски инструменти.

Најчесто 1 клеточна линија се одмрзнува во исто време 1-2 минути, со нежно вртлог во водена бања со температура од 37℃ додека не остане само мало парче мраз во вијалата пред да се измијат во претходно загреан медиум за раст.

За некои клетки како што се ембриони од цицачи, бавното затоплување е од суштинско значење за нивниот опстанок.

Клетките сега се подготвени за клеточна култура, клеточна изолација или во случај на хематопоетски матични клетки - студии за одржливост за да се гарантира интегритетот на матичните клетки донатори пред миелоаблативната терапија.

Нормална практика е да се земат мали делови од претходно измиениот примерок што се користи за да се изврши броење на клетки за да се одредат клеточните концентрации за обложување во културата. Потоа можете да ги процените резултатите од процедурите за изолација на клетките и да ја одредите одржливоста на клетките.

Најдобри практики за складирање на криовијали

Успешната криопрезервација на примероците складирани во криовијали зависи од многу елементи во протоколот, вклучувајќи соодветно складирање и водење евиденција.

• Поделете ги ќелиите помеѓу локациите за складирање– Доколку волумените дозволуваат, поделете ги ќелиите помеѓу ампулите и складирајте ги на посебни локации за да го намалите ризикот од губење на примерокот поради дефекти на опремата.
• Спречете вкрстена контаминација– Одлучете се за стерилни криогени вијали за еднократна употреба или автоклавирајте пред последователна употреба
• Користете ампули со соодветна големина за вашите клетки– вијалите доаѓаат во опсег од волумени помеѓу 1 и 5 ml. Избегнувајте преполнување на ампули за да се намали ризикот од пукање.
• Изберете криогени вијали со внатрешен или надворешен навој– Вијалите со внатрешно навој се препорачуваат од некои универзитети за безбедносни мерки – тие исто така можат да спречат контаминација при полнење или кога се складираат во течен азот.
• Спречете истекување- Користете двојно вбризгувани заптивки обликувани во капачето за завртка или О-прстените за да спречите истекување и контаминација.
• Користете 2D баркодови и шишиња со етикети– за да се обезбеди следливост, ампулите со големи површини за пишување овозможуваат секоја вијала да биде соодветно означена. 2D бар-кодовите можат да помогнат во управувањето со складирањето и водење евиденција. Капчињата со кодирани бои се корисни за полесна идентификација.
• Соодветно одржување на складирањето- За да се осигура дека клетките не се изгубени, садовите за складирање треба постојано да ја следат температурата и нивото на течен азот. Треба да се вградат аларми за да ги предупредат корисниците за грешки.

Безбедносни мерки на претпазливост

Течниот азот стана вообичаена практика во современите истражувања, но носи ризик од сериозни повреди доколку се користи неправилно.

Треба да се носи соодветна лична заштитна опрема (ППЕ) за да се минимизира ризикот од смрзнатини, изгореници и други негативни инциденти при ракување со течен азот. Носете

• Криогени ракавици
• Лабораториски слој
• Целосен штит за лице отпорен на удари кој го покрива и вратот
• Чевли со затворени пети
• Пластична престилка отпорна на прскање

Фрижидерите со течен азот треба да се постават во добро проветрени простори за да се минимизира ризикот од задушување - азот што истекува испарува и го поместува атмосферскиот кислород. Продавниците со големи количини треба да имаат алармни системи со низок кислород.

Работата во парови при ракување со течен азот е идеална и неговата употреба надвор од нормалното работно време треба да биде забранета.

Cryovials за поддршка на вашиот работен тек

Компанијата Suzhou Ace Biomedical нуди широк избор на производи кои ги задоволуваат вашите потреби за криопрезервација за различни типови на клетки. Портфолиото вклучува низа тубези и низа стерилни криовијали.

Нашите криовијали се:

• Лабораториска завртка капа 0,5 мл 1,5 мл 2,0 мл криовијални криогени ампули Конусна долна криотуба со заптивка

  ● 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml спецификација, со здолниште или без здолниште
  ● Достапни се и конусен или самостоечки дизајн, стерилен или нестерилен
  ● Цевките со капаче за завртки се направени од полипропилен од медицински квалитет
  ● PP Cryotube вијалите може постојано да се замрзнуваат и одмрзнуваат
  lДизајнот на надворешното капаче може да ја намали веројатноста за контаминација за време на обработката на примерокот.
  ● Криогенски цевки со капаче за завртки Универзални навои за завртки за употреба
  ● Цевките одговараат на највообичаените ротори
  ● О-ринг цевките со криогена цевка одговараат на стандардни кутии за замрзнување од 1 инчи и 2 инчи, 48 бунари, 81 бунари, 96 бунари и 100 бунари
  ● Се автоклавува до 121°C и се замрзнува до -86°C

  ДЕЛ БР	МАТЕРИЈАЛ	ВОЛУМЕН	CAPБОЈА	PCS/ЧЕШТА	ЧЕСТИ/КУЌАЈ
  ACT05-BL-N	PP	0,5 мл	Црна, Жолта, Сина, Црвена, Виолетова, Бела	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 мл	Црна, Жолта, Сина, Црвена, Виолетова, Бела	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 мл	Црна, Жолта, Сина, Црвена, Виолетова, Бела	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 мл	Црна, Жолта, Сина, Црвена, Виолетова, Бела	500	10