И покрај тоа што во теорија, една молекула на образецот би бил доволен, значително поголеми количини на ДНК обично се користат за класичен ПЦР, на пример, до 1 мг геномска ДНК на цицачи и малку како 1 стр. Плазмидна ДНК. Оптималната сума зависи во голема мерка од бројот на копии од целната секвенца, како и од неговата сложеност.
Ако се користи многу малку образец, ќе биде потребно соодветно зголемување на бројот на циклуси на засилување за да се добие доволна количина на производ. Taq полимераза што се користи за повеќето експерименти со PCR не има функција за корекција (3′-5 ′ активност на егзонуклеаза); Така, грешките што се случуваат при засилување не можат да се поправат. Колку е поголем бројот на циклуси, толку е поприсутно засилување на недостаток на производ. Ако, од друга страна, количината на образец е превисока, ќе се зголеми веројатноста за прајмери кои се однесуваат на други (не сто проценти бесплатни) секвенци, како и формирање на димери на буквар, што ќе резултира во засилување на засилувањето на нуспроизводи. Во многу случаи, ДНК е изолирана од клеточни култури или од микроорганизми и последователно се користи како образец за ПЦР. По прочистувањето, неопходно е да се утврди концентрацијата на ДНК за да може да се дефинира волуменот што е потребен за поставувањето на PCR. Додека електрофорезата на агароза гел може да послужи за да се обезбеди проценка, овој метод е далеку од точен. УВ-вис спектрофотометрија е утврдена како златен стандард за квантификација на нуклеински киселини; Овој директен и затоа лесен и брз метод ја мери апсорпцијата на примерокот на 260 nm, а концентрацијата се пресметува со помош на фактор на конверзија.
Ако концентрацијата на ДНК е многу мала, сепак (<1 μg/ml dsDNA), или ако е загадена со супстанции кои исто така апсорбираат во опсегот од 260 nm (на пр. РНК, протеини, соли), овој метод ќе ги достигне своите ограничувања. Во случај на многу ниски концентрации, читањата наскоро ќе станат премногу неточни за да бидат од корист, а загадувањата ќе доведат до (понекогаш огромно) преценување на вистинската вредност. Во овој случај, квантификацијата со употреба на флуоресценција може да претставува алтернатива. Оваа техника се заснова на употреба на флуоресцентна боја која се врзува специјално за dsDNA само комплексот што содржи нуклеинска киселина и бојата е возбудена од светлината, а последователно ќе испушти светлина од малку поголема бранова должина. Овде, интензитетот на флуоресцентниот сигнал е пропорционален со количината на ДНК, а за утврдување на концентрацијата се оценува во однос на стандардната крива. Предностите на овој метод се потпираат на специфичноста на врската, што ги исклучува надворешните влијанија воведени со загадување, како и на добиената можност за откривање на многу ниски концентрации на ДНК. Соодветливоста на кој било метод зависи главно од концентрацијата на примерокот и чистотата; Во многу случаи, дури може да биде препорачливо да се применуваат двата метода паралелно.
Време на објавување: ноември-30-2022