Krioviāliparasti izmanto šūnu līniju un citu kritisku bioloģisko materiālu kriogēnai uzglabāšanai Dewars, kas piepildīts ar šķidro slāpekli.

Veiksmīgai šūnu saglabāšanai šķidrā slāpeklī ir vairāki posmi. Lai gan pamatprincips ir lēna sasaldēšana, precīza izmantotā tehnika ir atkarīga no šūnas veida un izmantotā krioprotektora. Uzglabājot šūnas tik zemā temperatūrā, ir jāņem vērā vairāki drošības apsvērumi un labākā prakse.

Šīs ziņas mērķis ir sniegt pārskatu par to, kā krioviāli tiek uzglabāti šķidrā slāpeklī.

Kas ir krioviāli

Krioviāli ir mazi flakoni ar vāciņu, kas paredzēti šķidru paraugu uzglabāšanai ārkārtīgi zemā temperatūrā. Tie nodrošina, ka krioprotektantā saglabātās šūnas nenonāk tiešā saskarē ar šķidro slāpekli, samazinot šūnu lūzumu risku, vienlaikus gūstot labumu no šķidrā slāpekļa ārkārtējās dzesēšanas efekta.

Flakoni parasti ir pieejami dažāda tilpuma un dizaina diapazonā – tie var būt ar iekšējo vai ārējo vītni ar plakanu vai noapaļotu dibenu. Ir pieejami arī sterili un nesterili formāti.

Kas lietoCyrovialsuzglabāt šūnas šķidrā slāpeklī

Daudzas NHS un privātās laboratorijas, kā arī pētniecības iestādes, kas specializējas nabassaites asiņu banku veidošanā, epitēlija šūnu bioloģijā, imunoloģijā un cilmes šūnu bioloģijā, izmanto krioviālus šūnu kriokonservēšanai.

Šādā veidā saglabātās šūnas ietver B un T šūnas, CHO šūnas, hematopoētiskās cilmes un cilmes šūnas, hibridomas, zarnu šūnas, makrofāgus, mezenhimālās cilmes un cilmes šūnas, monocītus, mielomas, NK šūnas un pluripotentās cilmes šūnas.

Pārskats par to, kā uzglabāt krioviālus šķidrā slāpeklī

Kriokonservācija ir process, kas saglabā šūnas un citas bioloģiskās konstrukcijas, atdzesējot tās līdz ļoti zemai temperatūrai. Šūnas var uzglabāt šķidrā slāpeklī gadiem ilgi, nezaudējot šūnu dzīvotspēju. Šis ir izmantoto procedūru izklāsts.

Šūnu sagatavošana

Precīza paraugu sagatavošanas metode atšķiras atkarībā no šūnu veida, bet kopumā šūnas tiek savāktas un centrifugētas, lai izveidotu ar šūnām bagātu granulu. Pēc tam šo granulu atkārtoti suspendē supernatantā, kas sajaukts ar krioprotektantu vai kriokonservēšanas vidi.

Krioprezervācijas vide

Šo barotni izmanto, lai saglabātu šūnas zemas temperatūras vidē, kurai tās tiks pakļautas, kavējot intracelulāru un ārpusšūnu kristālu veidošanos un līdz ar to šūnu nāvi. To uzdevums ir nodrošināt drošu, aizsargājošu vidi šūnām un audiem sasaldēšanas, uzglabāšanas un atkausēšanas laikā.

Vidi, piemēram, svaigi sasaldētu plazmu (FFP), heparinizētu plazmlīta šķīdumu vai serumu nesaturošus, dzīvnieku komponentus nesaturošus šķīdumus sajauc ar krioprotektoriem, piemēram, dimetilsulfoksīdu (DMSO) vai glicerīnu.

Atkārtoti sašķidrinātās parauga granulas tiek sadalītas polipropilēna krioviālos, piemēram,Biomedicīnas uzņēmuma Suzhou Ace kriogēnās uzglabāšanas flakoni.

Ir svarīgi nepārpildīt krioviālus, jo tas palielinās plaisāšanas un satura iespējamās izdalīšanās risku (1).

Kontrolēts iesaldēšanas ātrums

Parasti veiksmīgai šūnu kriokonservācijai tiek izmantots lēns kontrolēts sasaldēšanas ātrums.

Pēc tam, kad paraugi ir sadalīti kriogēnos flakonos, tos novieto uz slapja ledus vai 4℃ ledusskapī un 5 minūšu laikā sāk sasaldēšanas procedūru. Kā vispārīgs norādījums, šūnas tiek atdzesētas ar ātrumu -1 līdz -3 minūtē (2). To panāk, izmantojot programmējamu dzesētāju vai ievietojot flakonus izolētā kastē, kas ievietota –70°C līdz –90°C kontrolētā ātruma saldētavā.

Pārnes uz šķidro slāpekli

Pēc tam sasaldētos kriogēnos flakonus uz nenoteiktu laiku pārnes uz šķidrā slāpekļa tvertni, ja tiek uzturēta temperatūra, kas zemāka par -135 ℃.

Šīs īpaši zemās temperatūras var iegūt, iegremdējot šķidrā vai tvaika fāzes slāpeklī.

Šķidrā vai tvaika fāze?

Ir zināms, ka uzglabāšana šķidrā fāzē slāpeklī uztur aukstu temperatūru ar absolūtu konsistenci, bet bieži vien nav ieteicama šādu iemeslu dēļ:

• Nepieciešamība pēc liela apjoma (dziļuma) šķidrā slāpekļa, kas ir potenciāls apdraudējums. Apdegumi vai nosmakšana tādēļ ir reāls risks.
• Dokumentēti krusteniskās inficēšanās gadījumi ar infekcijas izraisītājiem, piemēram, aspergillus, hep B un vīrusu izplatība šķidrā slāpekļa vidē (2,3)
• Iespējama šķidrā slāpekļa noplūde flakonos iegremdēšanas laikā. Izņemot no noliktavas un sasildot līdz istabas temperatūrai, slāpeklis strauji izplešas. Līdz ar to flakons var saplīst, kad to izņem no šķidrā slāpekļa krātuves, radot apdraudējumu gan no lidojošām atkritumiem, gan satura iedarbības (1, 4).

Šo iemeslu dēļ īpaši zemas temperatūras uzglabāšana visbiežāk notiek tvaika fāzes slāpeklī. Ja paraugi jāuzglabā šķidrā fāzē, jāizmanto specializētas krioflex caurules.

Tvaika fāzes mīnuss ir tāds, ka var rasties vertikāls temperatūras gradients, kas izraisa temperatūras svārstības no -135 ℃ līdz -190 ℃. Tāpēc ir rūpīgi un rūpīgi jāuzrauga šķidrā slāpekļa līmenis un temperatūras svārstības (5).

Daudzi ražotāji iesaka krioviālus piemērot uzglabāšanai līdz -135 ℃ vai lietošanai tikai tvaika fāzē.

Kriokonservēto šūnu atkausēšana

Atkausēšanas procedūra ir saspringta saldētai kultūrai, un ir nepieciešama pareiza apstrāde un tehnika, lai nodrošinātu optimālu šūnu dzīvotspēju, atjaunošanos un funkcionalitāti. Precīzi atkausēšanas protokoli būs atkarīgi no konkrētiem šūnu veidiem. Tomēr ātra atkausēšana tiek uzskatīta par standartu, lai:

• Samaziniet jebkādu ietekmi uz šūnu atjaunošanos
• Palīdz samazināt sasalšanas vidē esošo izšķīdušo vielu iedarbības laiku
• Samaziniet ledus pārkristalizācijas radītos bojājumus

Paraugu atkausēšanai parasti izmanto ūdens vannas, lodīšu vannas vai specializētus automatizētus instrumentus.

Visbiežāk 1 šūnu līnija tiek atkausēta vienā reizē 1-2 minūtes, maigi virpot 37 ℃ ūdens vannā, līdz flakonā ir palicis nedaudz ledus, pirms tās tiek mazgātas iepriekš uzsildītā augšanas vidē.

Dažām šūnām, piemēram, zīdītāju embrijiem, lēna sasilšana ir būtiska to izdzīvošanai.

Šūnas tagad ir gatavas šūnu kultivēšanai, šūnu izolēšanai vai hematopoētisko cilmes šūnu gadījumā – dzīvotspējas pētījumiem, lai garantētu donora cilmes šūnu integritāti pirms mieloablatīvās terapijas.

Normāla prakse ir ņemt nelielas alikvotas iepriekš mazgātā parauga, ko izmanto, lai veiktu šūnu skaitīšanu, lai noteiktu šūnu koncentrāciju platēšanai kultūrā. Pēc tam varat novērtēt šūnu izolācijas procedūru rezultātus un noteikt šūnu dzīvotspēju.

Krioviālu uzglabāšanas labākā prakse

Krioviālos uzglabāto paraugu veiksmīga kriokonservēšana ir atkarīga no daudziem protokola elementiem, tostarp pareizas uzglabāšanas un uzskaites.

• Sadaliet šūnas starp uzglabāšanas vietām– Ja tilpums atļauj, sadaliet šūnas pa flakoniem un uzglabājiet tās atsevišķās vietās, lai samazinātu parauga zuduma risku aprīkojuma kļūmju dēļ.
• Novērst savstarpēju piesārņojumu– Pirms turpmākās lietošanas izvēlieties vienreiz lietojamus sterilus kriogēnos flakonus vai autoklāvu
• Izmantojiet šūnām atbilstoša izmēra flakonus– flakoni ir pieejami dažāda tilpuma diapazonā no 1 līdz 5 ml. Izvairieties no flakonu pārpildīšanas, lai samazinātu plaisāšanas risku.
• Izvēlieties kriogēnos flakonus ar iekšējo vai ārējo vītni– Dažas augstskolas drošības pasākumiem iesaka flakonus ar iekšējo vītni – tie var arī novērst piesārņojumu uzpildes laikā vai uzglabājot šķidrā slāpeklī.
• Novērst noplūdi- Izmantojiet divreiz iesmidzinātas blīves, kas iestrādātas skrūvējamā vāciņā vai O-gredzenos, lai novērstu noplūdi un piesārņojumu.
• Izmantojiet 2D svītrkodus un etiķetes flakonus– lai nodrošinātu izsekojamību, flakoni ar lieliem rakstāmlaukumiem ļauj atbilstoši marķēt katru flakonu. 2D svītrkodi var palīdzēt krātuves pārvaldībā un uzskaitē. Krāsu kodēti vāciņi ir noderīgi vieglākai identificēšanai.
• Atbilstoša uzglabāšanas apkope- Lai nodrošinātu, ka šūnas netiek zaudētas, uzglabāšanas traukiem pastāvīgi jāuzrauga temperatūra un šķidrā slāpekļa līmenis. Signalizācijas ir jāaprīko, lai brīdinātu lietotājus par kļūdām.

Drošības pasākumi

Šķidrais slāpeklis ir kļuvis par ierastu praksi mūsdienu pētījumos, taču tas rada nopietnu ievainojumu risku, ja to lieto nepareizi.

Jāvalkā atbilstoši individuālie aizsardzības līdzekļi (IAL), lai samazinātu apsaldējumu, apdegumu un citu nelabvēlīgu negadījumu risku, strādājot ar šķidro slāpekli. Valkāt

• Kriogēnie cimdi
• Laboratorijas mētelis
• Triecienizturīgs pilnas sejas aizsargs, kas nosedz arī kaklu
• Kurpes ar slēgtu purngalu
• Šļakatu necaurlaidīgs plastmasas priekšauts

Šķidrā slāpekļa ledusskapji jānovieto labi vēdināmās vietās, lai samazinātu nosmakšanas risku – izplūdušais slāpeklis iztvaiko un izspiež atmosfēras skābekli. Liela apjoma veikalos jābūt zema skābekļa signalizācijas sistēmām.

Darbs pa pāriem, strādājot ar šķidro slāpekli, ir ideāls, un tā lietošana ārpus parastā darba laika ir jāaizliedz.

Krioviāli jūsu darbplūsmas atbalstam

Uzņēmums Suzhou Ace Biomedical piedāvā plašu produktu izvēli, kas atbilst jūsu kriokonservācijas vajadzībām dažādu veidu šūnām. Portfelis ietver virkni cauruļu, kā arī virkni sterilu krioviālu.

Mūsu krioviāli ir:

• Laboratorijas skrūvējams vāciņš

  ● 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml specifikācija, ar svārkiem vai bez svārkiem
  ● Ir pieejami gan konusveida, gan patstāvīgi stāvoši dizaini, gan sterili, gan nesterili
  ● Skrūvējamās vāciņa caurules ir izgatavotas no medicīniskā polipropilēna
  ● PP kriotubeļu flakonus var atkārtoti sasaldēt un atkausēt
  ● Ārējā vāciņa dizains var samazināt piesārņojuma iespējamību parauga apstrādes laikā.
  ● Kriogēnās caurules ar skrūvējamu vāciņu Universālas skrūvju vītnes lietošanai
  ● Caurules der lielākajai daļai rotoru
  ● Kriogēno cauruļu blīvgredzena caurules ir piemērotas standarta 1 collu un 2 collu, 48 iedobju, 81 iedobju, 96 iedobju un 100 iedobju saldētavas kastēm.
  ● Autoklāvējams līdz 121°C un sasaldējams līdz -86°C

  DAĻAS NR	MATERIĀLS	VOLUME	KLPKRĀSA	PCS/MOMA	SOMAS/KOPA
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Melns, Dzeltens, Zils, Sarkans, Violets, Balts	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Melns, Dzeltens, Zils, Sarkans, Violets, Balts	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Melns, Dzeltens, Zils, Sarkans, Violets, Balts	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Melns, Dzeltens, Zils, Sarkans, Violets, Balts	500	10