Krioviķiparasti tiek izmantoti šūnu līniju un citu kritisku bioloģisko materiālu kriogēnai uzglabāšanai rejās, kas piepildītas ar šķidru slāpekli.

Veiksmīgā šūnu saglabāšanā šķidrā slāpeklī ir iesaistīti vairāki posmi. Kaut arī pamatprincips ir lēns iesaldēšana, precīza izmantotā tehnika ir atkarīga no izmantotā šūnu tipa un izmantotā krioaizsardzības līdzekļa. Uzglabājot šūnas tik zemā temperatūrā, ir vairāki drošības apsvērumi un paraugprakse, kas jāņem vērā.

Šīs ziņas mērķis ir sniegt pārskatu par to, kā kriovials tiek uzglabāti šķidrā slāpeklī.

Kas ir kriovions

Cryovials ir mazi, ierobežoti flakoni, kas paredzēti šķidruma paraugu glabāšanai ārkārtīgi zemā temperatūrā. Tie nodrošina, ka šūnās, kas saglabātas krioaizsardzības līdzekļos, nav tiešā saskarē ar šķidro slāpekli, samazinot šūnu lūzumu risku, vienlaikus gūstot labumu no šķidrā slāpekļa galējā dzesēšanas efekta.

Flakoni parasti ir pieejami daudzos apjomos un dizainos - tie var būt iekšēji vai ārēji vītni ar plakaniem vai noapaļotiem dibeniem. Ir pieejami arī sterili un nesterili formāti.

Kurš izmantoCyrovialsLai saglabātu šūnas šķidrā slāpeklī

NHS un privāto laboratoriju klāsts, kā arī pētniecības iestādes, kas specializējas nabassaites asiņu bankās, epitēlija šūnu bioloģijā, imunoloģijā un cilmes šūnu bioloģijā, tiek izmantoti krioviali, lai šūnās.

Šādā veidā saglabātās šūnās ietilpst B un T šūnas, CHO šūnas, hematopoētiskās cilmes un priekšteču šūnas, hibridomas, zarnu šūnas, makrofāgi, mezenhimālā cilmes un priekšteča šūnas, monocīti, mieloma, NK šūnas un pluripotentās cilmes šūnas.

Pārskats par to, kā uzglabāt krioviālos šķidrā slāpeklī

Kriokonservācija ir process, kas saglabā šūnas un citas bioloģiskas konstrukcijas, atdzesējot tās līdz ļoti zemai temperatūrai. Šūnas var uzglabāt šķidrā slāpeklī gadiem ilgi, nezaudējot šūnu dzīvotspēju. Tas ir izmantoto procedūru izklāsts.

Šūnu sagatavošana

Precīza paraugu sagatavošanas metode mainīsies atkarībā no šūnu veida, bet kopumā šūnas tiek savāktas un centrifugētas, lai izstrādātu ar šūnām bagātu granulu. Pēc tam šo granulu atkārtoti suspendē supernatantā, kas sajaukts ar krioaizsardzības līdzekli vai kriokonservācijas nesēju.

Kriokonservācijas vide

Šī barotne tiek izmantota, lai saglabātu šūnas zemas temperatūras vidē, kurām tās tiks pakļautas, kavējot intra un ārpusšūnu kristālu veidošanos un līdz ar to šūnu nāvi. Viņu loma ir nodrošināt drošu, aizsargājošu vidi šūnām un audiem sasalšanas, uzglabāšanas un atkausēšanas procesu laikā.

Video, piemēram, svaiga saldēta plazma (FFP), heparinizēts plazmalītu šķīdums vai bez seruma, dzīvnieku komponentu šķīdumi tiek sajaukti ar krioaizsardzības līdzekļiem, piemēram, dimetilsulfoksīdu (DMSO) vai glicerīnu.

Atkārtoti nosauktā parauga granulas ir alikvotSuzhou Ace Biomedical Company kriogēno uzglabāšanas flaki.

Ir svarīgi nepagarināt krioviālos, jo tas palielinās plaisāšanas risku un iespējamo satura izdalīšanos (1).

Kontrolēts iesaldēšanas ātrums

Parasti veiksmīgai šūnu kriokonservēšanai tiek izmantots lēns kontrolēts iesaldēšanas ātrums.

Pēc tam, kad paraugi tiek alikvoti kriogēnos flakonos, tos novieto uz mitra ledus vai 4 ℃ ledusskapī, un sasalšanas procedūra tiek sākta 5 minūšu laikā. Kā vispārīgu ceļvedi šūnas atdzesē ar ātrumu no -1 līdz -3 minūtē (2). Tas tiek panākts, izmantojot programmējamu dzesētāju vai ievietojot flakonus izolētā kastē, kas ievietota –70 ° C līdz –90 ° C kontrolētā ātruma saldētavā.

Pārlejiet uz šķidru slāpekli

Pēc tam saldētie kriogēnie flakoni tiek pārnesti uz šķidru slāpekļa tvertni uz nenoteiktu laiku, ja tiek saglabāta temperatūra, kas mazāka par -135 ℃.

Šīs īpaši zemās temperatūras var iegūt, iegremdējot šķidruma vai tvaika fāzes slāpeklī.

Šķidruma vai tvaika fāze?

Ir zināms, ka uzglabāšana šķidrā fāzes slāpeklī uztur auksto temperatūru ar absolūtu konsistenci, bet to bieži nav ieteicams šādu iemeslu dēļ:

• Nepieciešamība pēc lieliem šķidra slāpekļa daudzumiem (dziļumam), kas ir potenciāls apdraudējums. Apdegumi vai nosmakšana, kas saistīta ar to, ir reāls risks.
• Dokumentēti gadījumi, kad infekcijas līdzekļi ir savstarpēji piesārņojušies, piemēram, Aspergillus, Hep B un vīrusu izplatība caur šķidro slāpekļa barotni (2,3)
• Šķidruma slāpekļa potenciāls iegremdēšanas laikā noplūst flakonos. Noņemts no uzglabāšanas un sasildīts līdz istabas temperatūrai, slāpeklis strauji paplašinās. Līdz ar to flakons var sagraut, ja to noņem no šķidrā slāpekļa uzglabāšanas, radot bīstamību gan no lidojošiem gružiem, gan satura iedarbības (1, 4).

Šo iemeslu dēļ īpaši zema temperatūras uzkrāšana visbiežāk notiek tvaika fāzes slāpeklī. Ja paraugi jāuzglabā šķidrā fāzē, jāizmanto specializēta Cryoflex caurule.

Tvaika fāzes negatīvie ir tas, ka var rasties vertikāls temperatūras gradients, kā rezultātā temperatūra svārstās no -135 ℃ līdz -190 ℃. Tas prasa rūpīgu un rūpīgu šķidruma slāpekļa līmeņa un temperatūras izmaiņu uzraudzību (5).

Daudzi ražotāji iesaka krioviali ir piemēroti uzglabāšanai līdz -135 ℃ vai izmantošanai tikai tvaika fāzē.

Atkausējot jūsu kriokonserētās šūnas

Atkausēšanas procedūra ir saspringta saldētai kultūrai, un, lai nodrošinātu šūnu optimālu dzīvotspēju, atveseļošanos un funkcionalitāti, ir nepieciešama pareiza apstrāde un tehnika. Precīzi atkausēšanas protokoli būs atkarīgi no konkrētiem šūnu tipiem. Tomēr ātra atkausēšana tiek uzskatīta par standartu:

• Samazināt jebkādu ietekmi uz šūnu atjaunošanos
• Palīdziet samazināt sasalšanas plašsaziņas līdzekļos esošo izšķīdušo vielu iedarbības laiku
• Samazināt visus ledus pārkristalizācijas bojājumus

Ūdens vannas, lodīšu vannas vai specializētus automatizētus instrumentus parasti izmanto paraugu atkausēšanai.

Visbiežāk 1 šūnu līnija tiek atkausēta vienlaikus 1-2 minūtes, viegli virpuļojot 37 ℃ Ūdens vannā, līdz flakonā ir palicis tikai neliels ledus, pirms tie tiek mazgāti iepriekš sildītā augšanas vidē.

Dažām šūnām, piemēram, zīdītāju embrijiem, to izdzīvošanai ir būtiska lēna sasilšana.

Šūnas tagad ir gatavas šūnu kultūrai, šūnu izolēšanai vai hematopoētisko cilmes šūnu gadījumā - dzīvotspējas pētījumiem, lai garantētu donora cilmes šūnu integritāti pirms mieloablatīvās terapijas.

Parastā prakse ir ņemt mazas iepriekš mazgātā parauga alikvotās daļas, ko izmanto šūnu skaita veikšanai, lai noteiktu šūnu koncentrāciju virpošanai kultūrā. Pēc tam jūs varat novērtēt šūnu izolācijas procedūru rezultātus un noteikt šūnu dzīvotspēju.

Labākā prakse kriovialu glabāšanai

Veiksmīga paraugu kriokonservācija, kas tiek glabāti krioviālos, ir atkarīgi no daudziem protokola elementiem, ieskaitot pareizu uzglabāšanas un ierakstu glabāšanu.

• Sadalīt šūnas starp uzglabāšanas vietām- Ja tilpumi to atļauj, sadaliet šūnas starp flakoniem un uzglabā tās atsevišķās vietās, lai samazinātu parauga zuduma risku aprīkojuma kļūmju dēļ.
• Novērst savstarpēju piesārņošanu-Pirms turpmākas lietošanas izvēlieties vienreiz lietojamus sterilus kriogēnus flakonus vai autoklāvu
• Izmantojiet atbilstoša izmēra flakonus savām šūnām- flakoniem ir daudz apjomu no 1 līdz 5 ml. Izvairieties no flakonu pārpildīšanas, lai samazinātu plaisāšanas risku.
• Atlasiet iekšējos vai ārēji vītņotos kriogēnos flakonus- Dažas universitātes drošības pasākumus iesaka iekšēji vītņotus flakonus - tie var arī novērst piesārņojumu pildīšanas laikā vai, ja tos glabā šķidrā slāpeklī.
• Novērst noplūdi-Lai novērstu noplūdi un piesārņojumu, izmantojiet biplīņus, kas veidoti skrūvju vāciņā vai O-gredzenos.
• Izmantojiet 2D svītrkodus un etiķetes flakonus- Lai nodrošinātu izsekojamību, flakoni ar lielām rakstīšanas vietām ļauj katram flakonam būt atbilstoši marķētiem. 2D svītrkodi var palīdzēt uzglabāšanas pārvaldībā un reģistrēšanā. Krāsu kodētie vāciņi ir noderīgi, lai vieglāk identificētu.
• Atbilstoša uzglabāšanas apkope- Lai nodrošinātu, ka šūnas netiek zaudētas, uzglabāšanas traukiem pastāvīgi jāuzrauga temperatūras un šķidruma slāpekļa līmenis. Lai brīdinātu lietotājus par kļūdām, jāaprīko trauksmes signāli.

Drošības pasākumi

Šķidrs slāpeklis ir kļuvis par ierastu praksi mūsdienu pētījumos, bet, ja to lieto, ir nopietna ievainojuma risks.

Lai samazinātu šķidro slāpekļa risku, ir jāvalkā pareiza personīgā aizsardzības iekārta (IAL), lai samazinātu apsaldējumu, apdegumu un citu nelabvēlīgu incidentu risku. Valkāt

• Kriogēnie cimdi
• Laboratorija
• Trieciena izturīgs pilnas sejas vairogs, kas arī aptver kaklu
• Close-toe apavi
• Splashproof plastmasas priekšauts

Šķidrie slāpekļa ledusskapji jāievieto labi vēdinātās vietās, lai samazinātu asfiksēšanas risku-izbēgis slāpeklis iztvaiko un izspiež atmosfēras skābekli. Liela apjoma krājumiem jābūt ar zemu skābekļa trauksmes sistēmu.

Darbs pa pāriem, apstrādājot šķidru slāpekli, ir ideāls, un tā lietošana ārpus parastā darba laika ir jāaizliedz.

Cryovials, lai atbalstītu jūsu darbplūsmu

Suzhou Ace Biomedical Company piedāvā plašu produktu klāstu, kas atbilst jūsu kriokonservācijas vajadzībām dažāda veida šūnām. Portfelī ir iekļauts virkne cauruļu, kā arī virkne sterilu krioviālu.

Mūsu krioviķi ir:

• Laboratorijas skrūvju vāciņš 0,5 ml 1,5 ml 2,0 ml krioviālais kriogēnie flakoni koniskie dibena kriotube ar blīvi

  ● 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml specifikācija ar svārkiem vai bez svārkiem
  ● Ir pieejami koniski vai pašpalīdzīgi dizains, gan sterils, gan nesterils
  ● Skrūvju vāciņa caurules ir izgatavotas no medicīniskās pakāpes polipropilēna
  ● PP kriotubes flakonus var atkārtoti sasaldēt un atkausēt
  ● Ārējā vāciņa dizains var samazināt piesārņojuma varbūtību parauga apstrādes laikā.
  ● Skrūvju vāciņa kriogēnās caurules universālas skrūvju vītnes lietošanai
  ● Caurules atbilst visizplatītākajiem rotoriem
  ● Kriogēnās caurules O-gredzenveida caurules ir piemērotas standarta 1 collu un 2 collu, 48well, 81well ， 96well un 100well saldētavas kastēm
  ● Autoklāvams līdz 121 ° C un sasaldējams līdz -86 ° C

  Daļa no	Materiāls	Tilpums	VāciņšKrāsa	PC/Somiņa	Somas/lieta
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Melna, dzeltena, zila, sarkana, purpursarkana, balta	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Melna, dzeltena, zila, sarkana, purpursarkana, balta	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Melna, dzeltena, zila, sarkana, purpursarkana, balta	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Melna, dzeltena, zila, sarkana, purpursarkana, balta	500	10