Procesu standartizācija ietver to optimizāciju un sekojošo izveidi un saskaņošanu, ļaujot ilgtermiņa optimālai veiktspējai-neatkarīgi no lietotāja. Standartizācija nodrošina augstas kvalitātes rezultātus, kā arī to reproducējamību un salīdzināmību.
(Klasiskā) PCR mērķis ir uzticama un reproducējama rezultāta ģenerēšana. Noteiktiem lietojumiem - ražaPCR produktsir arī aktuāls. Šīm reakcijām ir jārūpējas par to, lai paraugi netiktu apdraudēti un PCR darbplūsma paliek stabila. Konkrēti, tas nozīmē, ka samazina piesārņojuma ieviešanu, kas varētu izraisīt viltus pozitīvus vai viltus negatīvus rezultātus vai pat kavēt PCR reakciju. Turklāt reakcijas apstākļiem jābūt pēc iespējas identiskākiem katram atsevišķam paraugam skrējienā, un tie ir arī pārnesami turpmākajās reakcijās (tās pašas metodes). Tas attiecas uz reakciju sastāvu, kā arī uz temperatūras kontroles veidu cikliskā. Lietotāju kļūdas, protams, ir jāizvairās pēc iespējas vairāk.
Zemāk mēs parādīsim izaicinājumus, kas rodas sagatavošanās laikā un visā PCR darbībā - un pieejas risinājumiem, kas pastāv attiecībā uz instrumentiem un palīgmateriāliem, ko izmanto PCR darbplūsmu standartizēšanai.
Reakcijas sagatavošana
Reakcijas komponentu izsniegšana attiecīgi PCR traukos vai plāksnēs ietver vairākus izaicinājumus, kas jāpārvar:
Reakcijas apstākļi
Precīza un precīza atsevišķu komponentu dozēšana ir neaizstājama, cenšoties pēc iespējamiem identiskākajiem reakcijas apstākļiem. Papildus labai pipetēšanas paņēmienam ir kritiska izvēle par pareizo rīku. PCR galvenie sajaukumi bieži satur vielas, kas palielina viskozitāti vai rada putas. Pipetēšanas procesa laikā tie noved pie ievērojamas mitrināšanasPipette padomi, tādējādi samazinot pipetes precizitāti. Tiešo piešķiršanas sistēmu izmantošana vai alternatīvi pipetes padomi, kas ir mazāk pakļauti mitrināšanai, var uzlabot pipetēšanas procesa precizitāti un precizitāti.
Piesārņojums
Izdikšanas procesa laikā tiek ģenerēti aerosoli, kas, ja nākamā pipetēšanas posma laikā ļauj sasniegt pipetes iekšpusi, var potenciāli piesārņot citu paraugu. To var novērst, izmantojot filtru padomus vai tiešas pārvietošanas sistēmas.
Palīgmateriāli, piemēram,padomi, trauki un plāksnes, kuras izmanto PCR darbplūsmā, nedrīkst būt vielas, kas kompromitē paraugu vai vilto rezultātu. Tajos ietilpst DNS, DNASS, RNASS un PCR inhibitori, kā arī komponenti, kas reakcijas laikā var potenciāli izskaloties no materiāla - vielām, kas pazīstamas kā izskalojamas preces.
Lietotāja kļūda
Jo vairāk paraugu tiek apstrādāti, jo lielāks kļūdas risks. Var viegli notikt, ka paraugs ir pipete nepareizā traukā vai nepareizā akā. Šo risku var ievērojami samazināt, viegli saskatāma aku marķēšana. Izmantojot dozēšanas pakāpienu automatizāciju, “cilvēciskais faktors”, ti, kļūdas un ar lietotāju saistītās variācijas, tiek samazināti, tādējādi palielinot reproducējamību, it īpaši nelielu reakcijas apjomu gadījumā. Tas prasa pietiekami daudz dimensiju stabilitāti, lai tos izmantotu darbstacijā. Pievienotie svītrkodi nodrošina papildu lietojamību, kas vienkāršo paraugu izsekošanu visā procesā.
Termociklera programmēšana
Instrumenta programmēšana var izrādīties laikietilpīga, kā arī kļūdu pakļautība. Dažādas PCR termiskās ciklera funkcijas darbojas kopā, lai vienkāršotu šo procesa soli un, pats galvenais, lai tas būtu drošs:
Efektīvas programmēšanas pamatā ir ērta darbība un laba lietotāja norādījumi. Balstoties uz šo fondu, ar paroli aizsargāta lietotāju administrēšana neļaus citu lietotāju mainīt savas programmas. Ja tiek izmantoti vairāki velosipēdi (tāda paša veida), tas ir izdevīgi, ja programmu var pārsūtīt tieši no viena instrumenta uz otru, izmantojot USB vai savienojamību. Datoru programmatūra ļauj datorā centrālu un drošu programmu, lietotāju tiesību un dokumentu administrēšanu.
PCR skrējiens
Skrējiena laikā DNS tiek pastiprināts reakcijas traukā, kur katram paraugam jābūt pakļautiem identiskiem, konsekventiem reakcijas apstākļiem. Procesam ir svarīgi šādi aspekti:
Temperatūras kontrole
Lieliska precizitāte temperatūras kontrolē un ciklera bloka viendabīgums ir visu paraugu pat temperatūras kondicionēšanas pamats. Apkures un dzesēšanas elementu augstā kvalitāte (Peltier elementi), kā arī veids, kā tie ir savienoti ar bloku, ir izšķirošie faktori, kas noteiks temperatūras neatbilstību risku, kas pazīstams kā “malas efekts”
Iztvaikošana
Atsevišķu reakcijas komponentu koncentrācijai reakcijas laikā nevajadzētu mainīties iztvaikošanas dēļ. Pretējā gadījumā ir iespējams, ka ļoti mazPCR produktsvar ģenerēt, vai vispār nav. Tāpēc ir svarīgi samazināt iztvaikošanu, nodrošinot drošu blīvējumu. Šajā gadījumā termociklera apsildāmais vāks un asinsvada darba blīvējums rokā. Ir pieejamas dažādas blīvēšanas iespējasPCR plāksnes (saite: blīvēšanas raksts), ar kuru vislabākais blīvējums tiek sasniegts ar karstuma blīvēšanu. Var būt piemēroti arī citi slēgšana, ja vien ciklera vāka kontakta spiedienu var pielāgot izvēlētajam blīvējumam.
Procesa standartizācija ir ieviesta, lai ilgtermiņā aizsargātu precīzus un reproducējamus rezultātus. Tas ietver regulāru aprīkojuma apkopi, lai nodrošinātu, ka tas vienmēr ir labā darba stāvoklī. Visiem palīgmateriāliem jābūt konsekventi augstas kvalitātes visās saražotajās partijās, un to uzticamai pieejamībai ir jāgarantē.
Pasta laiks: 29.-2022. Novembris