Procesu standartizācija ietver to optimizāciju un sekojošu izveidošanu un saskaņošanu, ļaujot ilgtermiņā optimāli veikt – neatkarīgi no lietotāja. Standartizācija nodrošina augstas kvalitātes rezultātus, kā arī to reproducējamību un salīdzināmību.
(Klasiskā) PCR mērķis ir radīt uzticamu un reproducējamu rezultātu. Dažiem lietojumiem ražaPCR produktsir arī aktuāls. Šo reakciju gadījumā ir jānodrošina, lai paraugi netiktu apdraudēti un PCR darbplūsma paliek stabila. Konkrētāk, tas nozīmē, ka tiek samazināts piesārņojums, kas var izraisīt kļūdaini pozitīvus vai viltus negatīvus rezultātus vai pat kavēt PCR reakciju. Turklāt reakcijas apstākļiem jābūt pēc iespējas identiskiem katram atsevišķam paraugam darbības laikā, un tiem jābūt arī pārnesamiem uz nākamajām reakcijām (ar to pašu metodi). Tas attiecas uz reakciju sastāvu, kā arī uz temperatūras kontroles veidu ciklā. Protams, pēc iespējas jāizvairās no lietotāju kļūdām.
Tālāk mēs parādīsim problēmas, ar kurām saskaras PCR sagatavošanas laikā un visā tās darbības laikā, un pieejas risinājumiem, kas pastāv attiecībā uz instrumentiem un palīgmateriāliem, ko izmanto PCR darbplūsmu standartizēšanai.
Reakcijas sagatavošana
Reakcijas komponentu izdalīšana attiecīgi PCR traukos vai plāksnēs ietver vairākas problēmas, kas jāpārvar:
Reakcijas apstākļi
Precīza un precīza atsevišķo komponentu dozēšana ir obligāta, cenšoties panākt pēc iespējas identiskākos reakcijas apstākļus. Papildus labai pipetēšanas tehnikai ir ļoti svarīgi izvēlēties pareizo instrumentu. PCR pamatmaisījumi bieži satur vielas, kas palielina viskozitāti vai rada putas. Pipetēšanas procesa laikā tie ievērojami samitrinapipetes uzgaļi, tādējādi samazinot pipetēšanas precizitāti. Izmantojot tiešās dozēšanas sistēmas vai alternatīvus pipetes uzgaļus, kas ir mazāk pakļauti mitrināšanai, var uzlabot pipetēšanas procesa precizitāti un precizitāti.
Piesārņojumi
Dozēšanas procesa laikā tiek ģenerēti aerosoli, kas, ja tiem ļauj sasniegt pipetes iekšpusi, nākamajā pipetēšanas posmā var potenciāli piesārņot citu paraugu. To var novērst, izmantojot filtru uzgaļus vai tiešās pārvietošanas sistēmas.
Palīgmateriāli, piemēram,padomitraukos un plāksnēs, ko izmanto PCR darbplūsmā, nedrīkst būt vielas, kas apdraud paraugu vai vilto rezultātu. Tie ietver DNS, DNāzes, RNāzes un PCR inhibitorus, kā arī sastāvdaļas, kas reakcijas laikā var potenciāli izskaloties no materiāla – vielas, kas pazīstamas kā izskalojamās vielas.
Lietotāja kļūda
Jo vairāk paraugu tiek apstrādāts, jo lielāks kļūdu risks. Var viegli gadīties, ka paraugs ar pipeti tiek ievadīts nepareizajā traukā vai nepareizajā iedobē. Šo risku var ievērojami samazināt ar viegli pamanāmu urbumu marķējumu. Izmantojot dozēšanas soļu automatizāciju, tiek samazināts “cilvēciskais faktors”, ti, kļūdas un ar lietotāju saistītās variācijas, tādējādi palielinot reproducējamību, īpaši maza reakcijas apjoma gadījumā. Tas prasa, lai darbstacijā tiktu izmantotas plāksnes ar pietiekamu izmēru stabilitāti. Pievienotie svītrkodi nodrošina papildu mašīnlasāmību, kas vienkāršo paraugu izsekošanu visā procesā.
Termociklera programmēšana
Instrumenta programmēšana var izrādīties laikietilpīga, kā arī kļūdu iespējamība. Dažādas PCR termociklera funkcijas darbojas kopā, lai vienkāršotu šo procesa posmu un, pats galvenais, padarītu to drošu:
Vienkārša darbība un laba lietotāja instrukcija ir efektīvas programmēšanas pamatā. Balstoties uz šo pamatu, ar paroli aizsargāta lietotāju administrēšana neļaus citiem lietotājiem mainīt savas programmas. Ja tiek izmantoti vairāki (vienāda veida) ciklieri, ir izdevīgi, ja programmu var tieši pārsūtīt no viena instrumenta uz citu, izmantojot USB vai savienojumu. Datoru programmatūra nodrošina centrālu un drošu programmu, lietotāju tiesību un dokumentu administrēšanu datorā.
PCR palaišana
Darbības laikā DNS tiek pastiprināta reakcijas traukā, kur katrs paraugs jāpakļauj identiskiem, konsekventiem reakcijas apstākļiem. Procesam ir svarīgi šādi aspekti:
Temperatūras kontrole
Lieliska temperatūras kontroles precizitāte un ciklera bloka viendabīgums ir pamats visu paraugu vienmērīgai temperatūras kondicionēšanai. Sildīšanas un dzesēšanas elementu (peltjē elementu) augstā kvalitāte, kā arī veids, kādā tie ir savienoti ar bloku, ir noteicošie faktori, kas noteiks temperatūras neatbilstības risku, kas pazīstams kā "malas efekts".
Iztvaikošana
Atsevišķu reakcijas komponentu koncentrācija reakcijas gaitā nedrīkst mainīties iztvaikošanas dēļ. Citādi iespējams, ka ļoti mazPCR produktsvar tikt ģenerēts vai vispār netiek ģenerēts. Tāpēc ir ļoti svarīgi samazināt iztvaikošanu, nodrošinot drošu blīvējumu. Šajā gadījumā termociklera apsildāmais vāks un trauka blīvējums darbojas roku rokā. Ir pieejamas dažādas blīvēšanas iespējasPCR plāksnes (saite: blīvējuma izstrādājums), kur vislabākais blīvējums tiek panākts ar karstuma blīvēšanu. Var būt piemēroti arī citi aizdari, ja vien velosipēda vāka kontaktspiedienu var pielāgot izvēlētajam blīvējumam.
Ir ieviesta procesu standartizācija, lai ilgtermiņā nodrošinātu precīzus un reproducējamus rezultātus. Tas ietver regulāru aprīkojuma apkopi, lai nodrošinātu, ka tas vienmēr ir labā darba stāvoklī. Visiem palīgmateriāliem jābūt nemainīgi augstas kvalitātes visās ražotajās partijās, un ir jāgarantē to uzticama pieejamība.
Izsūtīšanas laiks: 2022. gada 29. novembris