Ievads
Kas ir nukleīnskābes ekstrakcija?
Vienkāršāk sakot, nukleīnskābes ekstrakcija ir RNS un/vai DNS noņemšana no parauga un visa liekā, kas nav nepieciešams. Ekstrakcijas procesā nukleīnskābes tiek izolētas no parauga un iegūtas koncentrēta eluāta veidā, kurā nav atšķaidītāju un piesārņotāju, kas varētu ietekmēt jebkādus pakārtotus lietojumus.
Nukleīnskābju ekstrakcijas pielietojumi
Attīrītas nukleīnskābes tiek izmantotas daudzos dažādos lietojumos, kas aptver vairākas dažādas nozares. Veselības aprūpe, iespējams, ir joma, kurā to izmanto visvairāk, un attīrīta RNS un DNS ir nepieciešama dažādiem testēšanas mērķiem.
Nukleīnskābju ekstrakcijas pielietojumi veselības aprūpē ietver:
- Nākamās paaudzes sekvencēšana (NGS)
- Uz pastiprināšanu balstīta SNP genotipēšana
- Uz masīvu balstīta genotipēšana
- Enzīmu gremošanas ierobežošana
- Analīzes, izmantojot modificējošus enzīmus (piemēram, ligāciju un klonēšanu)
Ne tikai veselības aprūpe, bet arī citas jomas, kurās tiek izmantota nukleīnskābju ekstrakcija, tostarp, bet ne tikai, paternitātes pārbaude, kriminālistika un genomika.
Īsa nukleīnskābes ekstrakcijas vēsture
DNS ekstrakcijadatēta senā pagātnē, un pirmo zināmo izolāciju 1869. gadā veica Šveices ārsts Frīdrihs Mišers. Miesšers cerēja atrisināt dzīvības pamatprincipus, nosakot šūnu ķīmisko sastāvu. Pēc neveiksmes ar limfocītiem viņš varēja iegūt neapstrādātas DNS nogulsnes no leikocītiem, kas atradās strutas uz izmestiem pārsējiem. Viņš to izdarīja, pievienojot šūnai skābi un pēc tam sārmu, lai atstātu šūnas citoplazmu, un pēc tam izstrādāja protokolu, lai atdalītu DNS no citiem proteīniem.
Pēc Miesšera revolucionāra pētījuma daudzi citi zinātnieki ir turpinājuši virzīties uz priekšu un izstrādāt DNS izolēšanas un attīrīšanas metodes. Olbaltumvielu zinātnieks Edvīns Džozefs Kons Otrā pasaules kara laikā izstrādāja daudzas proteīnu attīrīšanas metodes. Viņš bija atbildīgs par asins plazmas seruma albumīna frakcijas izolēšanu, kas ir svarīga osmotiskā spiediena uzturēšanai asinsvados. Tas bija ļoti svarīgi, lai karavīri būtu dzīvi.
1953. gadā Frensiss Kriks kopā ar Rozalindu Franklinu un Džeimsu Vatsonu noteica DNS struktūru, parādot, ka to veido divas garas nukleīnskābju nukleotīdu ķēdes. Šis atklājums pavēra ceļu Meselsonam un Stālam, kuri spēja izstrādāt blīvuma gradienta centrifugēšanas protokolu, lai izolētu DNS no E. Coli baktērijām, jo viņi 1958. gada eksperimenta laikā demonstrēja daļēji konservatīvu DNS replikāciju.
Nukleīnskābju ekstrakcijas metodes
Kādi ir 4 DNS ekstrakcijas posmi?
Visas ekstrakcijas metodes ir saistītas ar tiem pašiem pamata soļiem.
Šūnu darbības traucējumi. Šis posms, kas pazīstams arī kā šūnu līze, ietver šūnu sienas un/vai šūnu membrānas sadalīšanu, lai atbrīvotu intracelulāros šķidrumus, kas satur interesējošās nukleīnskābes.
Nevēlamu gružu noņemšana. Tas attiecas uz membrānas lipīdiem, olbaltumvielām un citām nevēlamām nukleīnskābes, kas var traucēt pakārtotos lietojumus.
Izolācija. Ir vairāki dažādi veidi, kā izolēt interesējošās nukleīnskābes no jūsu izveidotā attīrītā lizāta, kas ietilpst divās galvenajās kategorijās: uz šķīduma bāzes vai cietā stāvoklī (skatiet nākamo sadaļu).
Koncentrēšanās. Pēc tam, kad nukleīnskābes ir izolētas no visiem pārējiem piesārņotājiem un atšķaidītājiem, tās tiek pasniegtas ļoti koncentrētā eluātā.
Divi ekstrakcijas veidi
Ir divi nukleīnskābju ekstrakcijas veidi – šķīduma metodes un cietvielu metodes. Metode, kas balstīta uz šķīdumu, ir pazīstama arī kā ķīmiskās ekstrakcijas metode, jo tā ietver ķīmisko vielu izmantošanu, lai sadalītu šūnu un piekļūtu nukleīna materiālam. To var izmantot vai nu organiskos savienojumus, piemēram, fenolu un hloroformu, vai mazāk kaitīgus un tāpēc vairāk ieteicamus neorganiskus savienojumus, piemēram, proteināzi K vai silikagelu.
Dažādu ķīmiskās ekstrakcijas metožu piemēri šūnas sadalīšanai ir:
- Osmotisks membrānas plīsums
- Šūnu sienas fermentatīvā gremošana
- Membrānas šķīdināšana
- Ar mazgāšanas līdzekļiem
- Ar sārmu apstrādi
Cietvielu metodes, kas pazīstamas arī kā mehāniskās metodes, ietver DNS mijiedarbības ar cietu substrātu izmantošanu. Izvēloties lodītes vai molekulu, ar kuru DNS saistās, bet analizējamā viela nesaistīsies, ir iespējams tos atdalīt. Cietās fāzes ekstrakcijas metožu piemēri, tostarp silīcija dioksīda un magnētisko lodīšu izmantošana.
Izskaidrots magnētisko lodīšu ekstrakcija
Magnētisko lodīšu ekstrakcijas metode
Ekstrakcijas potenciāls, izmantojot magnētiskās lodītes, pirmo reizi tika atzīts ASV patentā, ko Vaithedas institūta pētniecības iestādei iesniedza Trevors Hokinss. Šis patents atzina, ka ir iespējams iegūt ģenētisko materiālu, saistot tos ar cietu nesēju, kas varētu būt magnētiska lodīte. Princips ir tāds, ka tiek izmantota ļoti funkcionāla magnētiskā lodīte, pie kuras saistīsies ģenētiskais materiāls, ko pēc tam var atdalīt no supernatanta, pieliekot magnētisku spēku tā trauka ārpusei, kurā atrodas paraugs.
Kāpēc izmantot magnētisko lodīšu ekstrakciju?
Magnētisko lodīšu ekstrakcijas tehnoloģija kļūst arvien izplatītāka, jo tajā ir potenciāls ātrai un efektīvai ekstrakcijas procedūrām. Pēdējā laikā ir izstrādātas ļoti funkcionālas magnētiskās lodītes ar piemērotām bufersistēmām, kas ir ļāvušas automatizēt nukleīnskābju ekstrakciju un darbplūsmu, kas ir ļoti resursi viegla un rentabla. Arī magnētisko lodīšu ekstrakcijas metodes neietver centrifugēšanas darbības, kas var izraisīt bīdes spēkus, kas sadala garākus DNS gabalus. Tas nozīmē, ka garākas DNS daļas paliek neskartas, kas ir svarīgi genomikas pārbaudēs.
Izsūtīšanas laiks: 2022. gada 25. novembris