Kriovialaidažniausiai naudojami kriogeniniam ląstelių linijų ir kitų svarbių biologinių medžiagų saugojimui skystu azotu pripildytuose Dewaruose.

Yra keletas etapų, susijusių su sėkmingu ląstelių išsaugojimu skystame azote. Nors pagrindinis principas yra lėtas užšaldymas, tiksli naudojama technika priklauso nuo ląstelės tipo ir naudojamo krioprotektanto. Laikant elementus tokioje žemoje temperatūroje, reikia atsižvelgti į keletą saugos aspektų ir geriausios praktikos.

Šiuo įrašu siekiama apžvelgti, kaip kriovialiai laikomi skystame azote.

Kas yra kriovialiai

Kriovialai yra maži, uždengti buteliukai, skirti skystiems mėginiams laikyti itin žemoje temperatūroje. Jie užtikrina, kad ląstelės, išsaugotos krioprotektante, tiesiogiai nesiliestų su skystuoju azotu, taip sumažinant ląstelių lūžių riziką, tuo pat metu išnaudojant itin didelį skysto azoto vėsinamąjį poveikį.

Buteliukai paprastai būna įvairaus tūrio ir dizaino – jie gali būti su vidiniu arba išoriniu sriegiu plokščiu arba apvaliu dugnu. Taip pat yra sterilių ir nesterilių formatų.

Kas naudojaCyrovialslaikyti ląsteles skystame azote

Įvairios NHS ir privačios laboratorijos, taip pat mokslinių tyrimų institucijos, besispecializuojančios virkštelės kraujo bankininkystės, epitelio ląstelių biologijos, imunologijos ir kamieninių ląstelių biologijos srityse, naudoja kriovialius ląstelėms užšaldyti.

Tokiu būdu išsaugotos ląstelės apima B ir T ląsteles, CHO ląsteles, hematopoetines kamienines ir pirmtakas, hibridomą, žarnyno ląsteles, makrofagus, mezenchimines kamienines ir pirmtakas, monocitus, mielomą, NK ląsteles ir pluripotentines kamienines ląsteles.

Kriovialų laikymo skystame azote apžvalga

Kriokonservavimas – tai procesas, kurio metu ląstelės ir kitos biologinės konstrukcijos išsaugomos jas atšaldant iki labai žemos temperatūros. Ląstelės gali būti laikomos skystame azote daugelį metų neprarandant ląstelių gyvybingumo. Tai yra taikomų procedūrų aprašymas.

Ląstelių paruošimas

Tikslus mėginių paruošimo metodas skirsis priklausomai nuo ląstelės tipo, tačiau paprastai ląstelės surenkamos ir centrifuguojamos, kad susidarytų daug ląstelių. Tada ši granulė resuspenduojama supernatante, sumaišytame su krioprotektante arba kriokonservavimo terpe.

Kriokonservavimo terpė

Ši terpė naudojama ląstelėms išsaugoti žemos temperatūros aplinkoje, kurioje jos bus veikiamos, nes slopina vidinių ir tarpląstelinių kristalų susidarymą, taigi ir ląstelių mirtį. Jų vaidmuo yra užtikrinti saugią, apsauginę aplinką ląstelėms ir audiniams šaldymo, laikymo ir atšildymo metu.

Terpė, tokia kaip šviežia šaldyta plazma (FFP), heparinizuotas plazmolito tirpalas arba tirpalai be serumo, gyvūninės kilmės komponentų neturintys tirpalai sumaišomi su krioprotektoriais, tokiais kaip dimetilsulfoksidas (DMSO) arba glicerolis.

Pakartotinai suskystintos mėginio granulės paskirstomos į polipropileno kriovialius, pvz„Suzhou Ace“ biomedicinos įmonė „Cryogenic Storage Vials“..

Svarbu neperpildyti kriovialų, nes tai padidins įtrūkimų ir galimo turinio išsiskyrimo riziką (1).

Kontroliuojamas užšalimo greitis

Paprastai sėkmingam ląstelių kriokonservavimui naudojamas lėtas kontroliuojamas užšalimo greitis.

Mėginius paskirstius į kriogeninius buteliukus, jie dedami ant šlapio ledo arba į 4 ℃ šaldytuvą ir užšaldymo procedūra pradedama per 5 minutes. Paprastai ląstelės vėsinamos nuo -1 iki -3 per minutę greičiu (2). Tai pasiekiama naudojant programuojamą aušintuvą arba įdedant buteliukus į izoliuotą dėžutę, dedamą į –70°C iki –90°C reguliuojamo greičio šaldiklį.

Perkelkite į skystąjį azotą

Užšaldyti kriogeniniai buteliukai neribotam laikui perkeliami į skysto azoto baką, jei palaikoma žemesnė nei -135 ℃ temperatūra.

Šias itin žemas temperatūras galima pasiekti panardinant į skystosios arba garų fazės azotą.

Skysta ar garų fazė?

Yra žinoma, kad laikymas skystoje fazėje azotu palaiko absoliučią šaltą temperatūrą, tačiau dažnai nerekomenduojama dėl šių priežasčių:

• Didelio skysčio azoto kiekio (gylio) poreikis, kuris yra galimas pavojus. Nudegimai ar uždusimas dėl to yra reali rizika.
• Dokumentuoti kryžminio užkrėtimo infekciniais sukėlėjais, tokiais kaip aspergillus, hepatito B ir viruso plitimo per skystą azoto terpę atvejai (2,3)
• Galimybė skysto azoto nutekėjimą į buteliukus panardinant. Išėmus iš saugyklos ir pašildytas iki kambario temperatūros, azotas greitai plečiasi. Dėl to buteliukas gali sudužti, kai išimamas iš skysto azoto saugyklos, ir gali kilti pavojus dėl skraidančių šiukšlių ir turinio poveikio (1, 4).

Dėl šių priežasčių ypač žemos temperatūros laikymas dažniausiai yra garų fazės azote. Kai mėginiai turi būti laikomi skystoje fazėje, reikia naudoti specializuotus krioflex vamzdelius.

Garų fazės trūkumas yra tas, kad gali atsirasti vertikalus temperatūros gradientas, dėl kurio temperatūra svyruoja nuo -135 ℃ iki -190 ℃. Dėl to būtina atidžiai ir stropiai stebėti skystojo azoto lygį ir temperatūros pokyčius (5).

Daugelis gamintojų rekomenduoja, kad kriovialiai būtų tinkami laikyti iki -135 ℃ arba naudoti tik garų fazėje.

Kriokonservuotų ląstelių atšildymas

Atšildymo procedūra sukelia įtampą užšaldytai kultūrai, todėl reikia tinkamai apdoroti ir tinkamai elgtis, kad būtų užtikrintas optimalus ląstelių gyvybingumas, atsigavimas ir funkcionalumas. Tikslūs atšildymo protokolai priklausys nuo konkrečių ląstelių tipų. Tačiau greitas atšildymas laikomas standartu:

• Sumažinkite bet kokį poveikį ląstelių atsigavimui
• Sutrumpinkite šaldymo terpėje esančių tirpių medžiagų poveikio laiką
• Sumažinkite bet kokią žalą dėl ledo perkristalizavimo

Mėginiams atšildyti dažniausiai naudojamos vandens vonios, granulių vonios arba specializuoti automatizuoti instrumentai.

Dažniausiai 1 ląstelių linija vienu metu atšildoma 1–2 minutes, švelniai sukant 37 ℃ vandens vonioje, kol buteliuke lieka tik šiek tiek ledo, prieš nuplaunant pašildytoje auginimo terpėje.

Kai kurioms ląstelėms, tokioms kaip žinduolių embrionai, lėtas atšilimas yra būtinas jų išlikimui.

Ląstelės dabar yra paruoštos ląstelių kultūrai, ląstelių izoliacijai arba, kraujodaros kamieninių ląstelių atveju, gyvybingumo tyrimams, siekiant užtikrinti donoro kamieninių ląstelių vientisumą prieš mieloabliacinį gydymą.

Įprasta paimti nedideles alikvotas iš anksto išplauto mėginio, naudojamo skaičiuojant ląsteles, kad būtų galima nustatyti ląstelių koncentraciją kultūroje. Tada galite įvertinti ląstelių išskyrimo procedūrų rezultatus ir nustatyti ląstelių gyvybingumą.

Geriausia kriovialų laikymo praktika

Kriovialuose laikomų mėginių sėkmingas šaldymas priklauso nuo daugelio protokolo elementų, įskaitant tinkamą saugojimą ir įrašų saugojimą.

• Padalinkite langelius tarp saugojimo vietų– Jei leidžia tūriai, padalinkite ląsteles tarp buteliukų ir laikykite jas atskirose vietose, kad sumažintumėte mėginio praradimo riziką dėl įrangos gedimų.
• Užkirsti kelią kryžminiam užteršimui– Prieš naudojimą rinkitės vienkartinius sterilius kriogeninius buteliukus arba autoklavą
• Naudokite tinkamo dydžio buteliukus savo ląstelėms– buteliukų yra nuo 1 iki 5 ml. Venkite perpildyti buteliukus, kad sumažintumėte įtrūkimų riziką.
• Pasirinkite kriogeninius buteliukus su vidine arba išorine sriegiu– Kai kurie universitetai rekomenduoja naudoti buteliukus su vidiniu sriegiu dėl saugos priemonių – jie taip pat gali apsaugoti nuo užteršimo pilant arba laikant skystame azote.
• Užkirsti kelią nuotėkiui- Kad išvengtumėte nuotėkio ir užteršimo, naudokite du kartus įpuršktus sandariklius, įspaustus į užsukamąjį dangtelį arba O-žiedus.
• Naudokite 2D brūkšninius kodus ir etiketes– Siekiant užtikrinti atsekamumą, buteliukai su dideliais rašymo plotais leidžia tinkamai paženklinti kiekvieną buteliuką. 2D brūkšniniai kodai gali padėti tvarkyti saugyklą ir tvarkyti įrašus. Spalvoti koduoti dangteliai yra naudingi, kad būtų lengviau atpažinti.
• Tinkama sandėliavimo priežiūra- Kad ląstelės neprarastų, laikymo indai turi nuolat stebėti temperatūrą ir skysto azoto kiekį. Norint įspėti vartotojus apie klaidas, turi būti įrengti aliarmai.

Saugos priemonės

Skystas azotas tapo įprasta šiuolaikinių tyrimų praktika, tačiau netinkamai naudojant kyla rimtų sužalojimų rizika.

Norint sumažinti nušalimo, nudegimų ir kitų nepageidaujamų incidentų riziką dirbant su skystu azotu, reikia dėvėti tinkamas asmenines apsaugos priemones (AAP). Nešioti

• Kriogeninės pirštinės
• Laboratorinis paltas
• Smūgiams atsparus viso veido skydelis, kuris taip pat dengia kaklą
• Batai uždaru nosimi
• Purslams atspari plastikinė prijuostė

Skysto azoto šaldytuvai turi būti pastatyti gerai vėdinamose vietose, kad būtų kuo mažesnė uždusimo rizika – išbėgęs azotas išgaruoja ir išstumia atmosferos deguonį. Didelės apimties parduotuvėse turėtų būti signalizacijos sistemos, kuriose mažai deguonies.

Darbas poromis dirbant su skystu azotu yra idealus ir jo naudojimas ne įprastomis darbo valandomis turėtų būti draudžiamas.

Kriovialiai jūsų darbo eigai palaikyti

Suzhou Ace Biomedical kompanija siūlo platų produktų pasirinkimą, atitinkantį jūsų skirtingų tipų ląstelių kriokonservavimo poreikius. Portfelį sudaro įvairūs vamzdeliai ir sterilūs kriovialiai.

Mūsų kriovialiai yra:

• Laboratorinis užsukamas dangtelis 0,5 ml 1,5 ml 2,0 ml kriovidiniai kriogeniniai buteliukai kūginio dugno kriogeninis vamzdelis su tarpine

  ● 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml specifikacijos, su sijonu arba be sijono
  ● Galimi tiek kūginiai, tiek stovintys, sterilūs arba nesterilūs
  ● Užsukami kamšteliai pagaminti iš medicininio polipropileno
  ● PP kriotuzių buteliukus galima pakartotinai užšaldyti ir atšildyti
  ●Išorinio dangtelio konstrukcija gali sumažinti užteršimo tikimybę apdorojant mėginį.
  ● Kriogeniniai vamzdeliai su užsukamu dangteliu Universalūs sriegiai, skirti naudoti
  ● Vamzdžiai tinka dažniausiai naudojamiems rotoriams
  ● Kriogeninių vamzdžių sandarinimo žiedų vamzdeliai tinka standartinėms 1 colio ir 2 colių, 48 šulinėlių, 81 šulinėlių, 96 šulinėlių ir 100 šulinėlių šaldymo dėžėms.
  ● Galima autoklavuoti iki 121°C ir užšaldyti iki -86°C

  DALIES NR	MEDŽIAGA	TOMAS	BŽŪPSPALVA	PCS/KREPŠELIS	KREPŠIAI / DĖKLAS
  ACT05-BL-N	PP	0,5 ml	Juoda, Geltona, Mėlyna, Raudona, Violetinė, Balta	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 ml	Juoda, Geltona, Mėlyna, Raudona, Violetinė, Balta	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 ml	Juoda, Geltona, Mėlyna, Raudona, Violetinė, Balta	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 ml	Juoda, Geltona, Mėlyna, Raudona, Violetinė, Balta	500	10