Įvadas
Kas yra nukleorūgščių ekstrahavimas?
Paprasčiausiai tariant, nukleino rūgšties ekstrahavimas yra RNR ir (arba) DNR pašalinimas iš mėginio ir viso nereikalingo pertekliaus. Ekstrahavimo procese nukleorūgštys išskiriamos iš mėginio ir gaunamos koncentruoto eliuato pavidalu, kuriame nėra skiediklių ir teršalų, galinčių turėti įtakos bet kokiam tolesniam naudojimui.
Nukleino rūgščių ekstrahavimo taikymas
Išgrynintos nukleorūgštys naudojamos įvairiose srityse, įvairiose pramonės šakose. Sveikatos priežiūra, ko gero, yra ta sritis, kurioje ji naudojama dažniausiai, o išgryninta RNR ir DNR reikalinga daugeliui skirtingų testavimo tikslų.
Nukleino rūgščių ekstrahavimo taikymas sveikatos priežiūros srityje apima:
- Naujos kartos sekvenavimas (NGS)
- Amplifikacija pagrįstas SNP genotipų nustatymas
- Masyvu pagrįstas genotipų nustatymas
- Fermentų virškinimo apribojimas
- Analizė naudojant modifikuojančius fermentus (pvz., Ligacija ir klonavimas)
Be sveikatos priežiūros, yra ir kitų sričių, kuriose naudojama nukleino rūgščių ekstrakcija, įskaitant, bet neapsiribojant, tėvystės tyrimus, teismo ekspertizę ir genomiką.
Trumpa nukleorūgščių ekstrahavimo istorija
DNR išskyrimas1869 m. pirmą kartą žinomą izoliaciją atliko šveicarų gydytojas Friedrichas Miescheris. Miescheris tikėjosi išspręsti pagrindinius gyvybės principus nustatydamas ląstelių cheminę sudėtį. Po nesėkmės su limfocitais jis sugebėjo gauti neapdorotas DNR nuosėdas iš leukocitų, rastų pūliuose ant išmestų tvarsčių. Jis tai padarė į ląstelę įpildamas rūgšties, o paskui šarmo, kad išeitų iš ląstelės citoplazmos, o tada sukūrė protokolą, kaip atskirti DNR nuo kitų baltymų.
Po novatoriškų Miescherio tyrimų daugelis kitų mokslininkų ėmėsi tobulėti ir plėtoti DNR izoliavimo ir gryninimo būdus. Edwinas Josephas Cohnas, baltymų mokslininkas, Antrojo pasaulinio karo metu sukūrė daugybę baltymų valymo metodų. Jis buvo atsakingas už serumo albumino frakcijos išskyrimą kraujo plazmoje, kuri yra svarbi palaikant osmosinį slėgį kraujagyslėse. Tai buvo labai svarbu, kad kariai išliktų gyvi.
1953 m. Francis Crick kartu su Rosalind Franklin ir James Watson nustatė DNR struktūrą, parodydamas, kad ji sudaryta iš dviejų ilgų nukleorūgščių nukleotidų grandinių. Šis proveržio atradimas atvėrė kelią Meselsonui ir Stahlui, kurie sugebėjo sukurti tankio gradiento centrifugavimo protokolą, skirtą DNR izoliuoti nuo E. Coli bakterijų, nes per 1958 m. eksperimentą jie įrodė pusiau konservatyvų DNR replikaciją.
Nukleino rūgščių ekstrahavimo būdai
Kokie yra 4 DNR išskyrimo etapai?
Visi gavybos metodai susideda iš tų pačių pagrindinių žingsnių.
Ląstelių sutrikimas. Šis etapas, dar žinomas kaip ląstelių lizė, apima ląstelės sienelės ir (arba) ląstelės membranos suardymą, kad būtų išleisti ląsteliniai skysčiai, kuriuose yra dominančių nukleino rūgščių.
Nepageidaujamų šiukšlių pašalinimas. Tai apima membraninius lipidus, baltymus ir kitas nepageidaujamas nukleorūgštis, kurios gali trukdyti tolesniam naudojimui.
Isolation. Yra daug skirtingų būdų, kaip išskirti dominančias nukleino rūgštis iš jūsų sukurto išvalyto lizato, kurie patenka į dvi pagrindines kategorijas: tirpalo pagrindu arba kietosios būsenos (žr. kitą skyrių).
Koncentracija. Išskyrus nukleorūgštis nuo visų kitų teršalų ir skiediklių, jos pateikiamos labai koncentruotame eliuate.
Du ištraukimo tipai
Yra du nukleino rūgščių ekstrahavimo tipai – tirpalo metodai ir kietojo kūno metodai. Tirpalu pagrįstas metodas taip pat žinomas kaip cheminio ekstrahavimo metodas, nes jis apima cheminių medžiagų naudojimą ląstelei suskaidyti ir pasiekti nukleino medžiagą. Tam gali būti naudojami organiniai junginiai, tokie kaip fenolis ir chloroformas, arba mažiau kenksmingi, todėl labiau rekomenduojami neorganiniai junginiai, tokie kaip proteinazė K arba silikagelis.
Įvairių cheminių ekstrahavimo metodų, skirtų ląstelei suskaidyti, pavyzdžiai:
- Osmosinis membranos plyšimas
- Fermentinis ląstelės sienelės virškinimas
- Membranos tirpinimas
- Su plovikliais
- Su šarminiu apdorojimu
Kietojo kūno metodai, taip pat žinomi kaip mechaniniai metodai, apima DNR sąveikos su kietu substratu išnaudojimą. Pasirinkus karoliuką arba molekulę, prie kurios prisijungs DNR, bet neprisijungs analitė, galima juos atskirti. Kietosios fazės ekstrahavimo metodų pavyzdžiai, įskaitant silicio dioksido ir magnetinių granulių naudojimą.
Magnetinių karoliukų ištraukimo paaiškinimas
Magnetinio karoliuko ekstrahavimo metodas
Ekstrahavimo naudojant magnetinius karoliukus potencialas pirmą kartą buvo pripažintas JAV patente, kurį pateikė Trevoras Hawkinsas Whitehead instituto tyrimų institucijai. Šis patentas pripažino, kad genetinę medžiagą galima išgauti surišant jas su kietu atraminiu nešikliu, kuris gali būti magnetinis karoliukas. Principas yra tas, kad jūs naudojate labai funkcionalizuotą magnetinį rutuliuką, prie kurio prisijungs genetinė medžiaga, kuri vėliau gali būti atskirta nuo supernatanto, veikiant magnetine jėga indo, kuriame laikomas mėginys, išorę.
Kodėl verta naudoti magnetinio karoliuko ekstraktą?
Magnetinių granulių ekstrahavimo technologija tampa vis labiau paplitusi, nes ji turi greitų ir veiksmingų ekstrahavimo procedūrų potencialą. Pastaruoju metu buvo kuriamos labai funkcionalios magnetinės granulės su tinkamomis buferinėmis sistemomis, kurios leido automatizuoti nukleorūgščių ekstrakciją ir darbo eigą, kuri yra labai lengva ir ekonomiška. Be to, magnetinių granulių ekstrahavimo metodai neapima centrifugavimo etapų, kurie gali sukelti šlyties jėgas, kurios suardo ilgesnius DNR gabalus. Tai reiškia, kad ilgesnės DNR grandinės lieka nepažeistos, o tai svarbu atliekant genomikos tyrimus.
Paskelbimo laikas: 2022-11-25