Nepaisant to, kad teoriškai pakaktų vienos šablono molekulės, klasikiniam PGR paprastai naudojamas žymiai didesnis DNR kiekis, pavyzdžiui, iki 1 µg genomo žinduolių DNR ir vos 1 pg plazmidės DNR. Optimalus kiekis daugiausia priklauso nuo tikslinės sekos kopijų skaičiaus, taip pat nuo jo sudėtingumo.
Jei naudojamas labai mažai šablono, norint gauti pakankamą kiekį produkto, reikės atitinkamo amplifikavimo ciklų skaičiaus padidėjimo. TAQ polimerazė, naudojama daugumai PGR eksperimentų, neturi pataisos funkcijos (3′-5 ′ egzonukleazės aktyvumas); Taigi amplifikacijos metu klaidų negalima ištaisyti. Kuo didesnis ciklų skaičius, tuo labiau paplitusi ydingo produkto amplifikacija. Kita vertus, jei šablono kiekis yra per didelis, pradmenų tikimybė atkaitins kitas (ne šimtą procentų nemokamų) sekų, taip pat pradmenų dimerų formavimasis padidės, o tai padidins sustiprinimą. šalutiniai produktai. Daugeliu atvejų DNR yra išskirta iš ląstelių kultūrų arba nuo mikroorganizmų ir vėliau naudojama kaip PGR šablonas. Po gryninimo būtina nustatyti DNR koncentraciją, kad būtų galima apibrėžti tūrį, reikalingą PGR sąrankai. Nors agarozės gelio elektroforezė gali padėti pateikti įvertinimą, šis metodas toli gražu nėra tikslus. UV-VIS spektrofotometrija buvo nustatyta kaip auksinis nukleorūgščių kiekybinio įvertinimo standartas; Šis tiesioginis, todėl lengvas ir greitas metodas matuoja mėginio absorbciją esant 260 nm, o koncentracija apskaičiuojama naudojant konversijos koeficientą.
Tačiau jei DNR koncentracija yra labai maža (<1 µg/ml dsDNR) arba jei ji užteršta medžiagomis, kurios taip pat absorbuoja 260 nm diapazone (pvz., RNR, baltymai, druskos), šis metodas pasieks savo apribojimus. Esant labai mažoms koncentracijoms, rodmenys greitai taps per daug netikslūs, kad būtų naudojami, o užterštai sukels (kartais didžiulį) pervertinimą tikrosios vertės. Tokiu atveju kiekybinis įvertinimas naudojant fluorescenciją gali būti alternatyva. Ši technika grindžiama fluorescencinio dažų naudojimu, kuris konkrečiai jungiasi su dsDNR, tik kompleksas, kurį sudaro nukleorūgštis ir dažai, sužadina šviesa, ir vėliau jis skleis šiek tiek didesnio bangos ilgio šviesą. Čia fluorescencinio signalo intensyvumas yra proporcingas DNR kiekiui ir nustatant koncentraciją, ji įvertinama standartinės kreivės atžvilgiu. Šio metodo pranašumai priklauso nuo ryšio specifiškumo, kuris pašalina užteršimo išorines įtaką, taip pat dėl to, kad atsiranda gebėjimas aptikti labai mažą DNR koncentraciją. Bet kurio metodo tinkamumas daugiausia priklauso nuo mėginio koncentracijos ir grynumo; Daugeliu atvejų netgi gali būti patartina naudoti abu metodus lygiagrečiai.
Pašto laikas: 2012 m. Lapkričio 30–30 d