Nors teoriškai pakaktų vienos šablono molekulės, klasikiniam PGR paprastai naudojami žymiai didesni DNR kiekiai, pavyzdžiui, iki 1 µg genominės žinduolių DNR ir vos 1 pg plazmidinės DNR. Optimalus kiekis labai priklauso nuo tikslinės sekos kopijų skaičiaus, taip pat nuo jos sudėtingumo.
Jei naudojamas labai mažas šablonas, norint gauti pakankamą produkto kiekį, reikės atitinkamai padidinti amplifikacijos ciklų skaičių. Taq polimerazė, kuri naudojama daugeliui PGR eksperimentų, neturi korekcijos funkcijos (3′-5′ egzonukleazės aktyvumas); taigi klaidos, atsiradusios stiprinimo metu, negali būti ištaisytos. Kuo didesnis ciklų skaičius, tuo labiau sustiprės gaminio trūkumas. Kita vertus, jei šablono kiekis yra per didelis, pradmenų susijungimo su kitomis (ne šimtu procentų papildomomis) sekomis, taip pat pradmenų dimerų susidarymo tikimybė padidės, o tai sukels pradmenų amplifikaciją. šalutiniai produktai. Daugeliu atvejų DNR išskiriama iš ląstelių kultūrų arba mikroorganizmų ir vėliau naudojama kaip PGR šablonas. Po valymo būtina nustatyti DNR koncentraciją, kad būtų galima nustatyti tūrį, reikalingą PGR nustatymui. Nors agarozės gelio elektroforezė gali padėti įvertinti, šis metodas toli gražu nėra tikslus. UV-Vis spektrofotometrija buvo nustatyta kaip auksinis nukleorūgščių kiekio nustatymo standartas; šiuo tiesioginiu, todėl lengvu ir greitu metodu matuojama mėginio absorbcija esant 260 nm, o koncentracija apskaičiuojama naudojant perskaičiavimo koeficientą.
Tačiau jei DNR koncentracija yra labai maža (< 1 µg/mL dsDNR) arba jei ji yra užteršta medžiagomis, kurios taip pat sugeria 260 nm diapazone (pvz., RNR, baltymai, druskos), šis metodas pasieks savo apribojimus. Esant labai mažoms koncentracijoms, rodmenys greitai taps pernelyg netikslūs, kad juos būtų galima naudoti, o užterštumas lems (kartais milžinišką) tikrosios vertės pervertinimą. Šiuo atveju alternatyva gali būti kiekybinis nustatymas naudojant fluorescenciją. Šis metodas pagrįstas fluorescencinių dažų, kurie specifiškai jungiasi su dsDNR, naudojimu, tik kompleksas, kurį sudaro nukleino rūgštis ir dažai, yra sužadinamas šviesa, o vėliau skleis šiek tiek didesnio bangos ilgio šviesą. Čia fluorescencinio signalo intensyvumas yra proporcingas DNR kiekiui, o koncentracijos nustatymui jis įvertinamas standartinės kreivės atžvilgiu. Šio metodo pranašumai priklauso nuo ryšio specifiškumo, kuris pašalina išorinį užteršimo poveikį, taip pat dėl galimo gebėjimo aptikti labai mažas DNR koncentracijas. Bet kurio metodo tinkamumas daugiausia priklauso nuo mėginio koncentracijos ir grynumo; daugeliu atvejų netgi patartina abu metodus taikyti lygiagrečiai.
Paskelbimo laikas: 2022-11-30