ພວກເຮົາຄວນເພີ່ມແມ່ແບບຫຼາຍປານໃດຕໍ່ກັບປະຕິກິລິຍາ PCR ຂອງຂ້ອຍ?

ເຖິງແມ່ນວ່າໃນທິດສະດີ, ຫນຶ່ງໂມເລກຸນຂອງແມ່ແບບຈະພຽງພໍ, ຢ່າງຫຼວງຫຼາຍຂອງ DNA ໂດຍທົ່ວໄປແມ່ນຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບ PCR ຄລາສສິກ, ສໍາລັບການຍົກຕົວຢ່າງ, ເຖິງ 1 µg ຂອງ DNA mammalian genomic ແລະເປັນພຽງເລັກນ້ອຍເປັນ 1 pg ຂອງ plasmid DNA. ຈໍານວນທີ່ດີທີ່ສຸດແມ່ນຂຶ້ນກັບຈໍານວນສໍາເນົາຂອງລໍາດັບເປົ້າຫມາຍ, ເຊັ່ນດຽວກັນກັບຄວາມສັບສົນຂອງມັນ.

ຖ້າໃຊ້ແມ່ແບບຫນ້ອຍຫຼາຍ, ການເພີ່ມຂື້ນທີ່ສອດຄ້ອງກັນໃນຈໍານວນຂອງຮອບວຽນການຂະຫຍາຍແມ່ນຈໍາເປັນເພື່ອໃຫ້ໄດ້ຜະລິດຕະພັນທີ່ພຽງພໍ. Taq polymerase ທີ່ຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບການທົດລອງ PCR ສ່ວນໃຫຍ່ບໍ່ມີຫນ້າທີ່ແກ້ໄຂ (ກິດຈະກໍາ 3′-5′ exonuclease); ດັ່ງນັ້ນ, ຄວາມຜິດພາດທີ່ເກີດຂື້ນໃນລະຫວ່າງການຂະຫຍາຍບໍ່ສາມາດຖືກແກ້ໄຂໄດ້. ຈໍານວນຮອບວຽນທີ່ສູງຂຶ້ນ, ການຂະຫຍາຍຜະລິດຕະພັນທີ່ບົກພ່ອງຈະແຜ່ຫຼາຍ. ໃນທາງກົງກັນຂ້າມ, ປະລິມານຂອງແມ່ແບບແມ່ນສູງເກີນໄປ, ຄວາມເປັນໄປໄດ້ຂອງ primers annealing ກັບລໍາດັບອື່ນໆ (ບໍ່ແມ່ນຫນຶ່ງຮ້ອຍສ່ວນຮ້ອຍຟຣີ) ລໍາດັບ, ເຊັ່ນດຽວກັນກັບການສ້າງ primer dimers, ຈະເພີ່ມຂຶ້ນ, ເຊິ່ງຈະສົ່ງຜົນໃຫ້ການຂະຫຍາຍຂອງ. ຜົນ​ຜະ​ລິດ​ຕະ​ພັນ. ໃນຫຼາຍໆກໍລະນີ, DNA ຖືກແຍກອອກຈາກວັດທະນະທໍາເຊນຫຼືຈາກຈຸລິນຊີແລະຕໍ່ມາຖືກນໍາໃຊ້ເປັນແມ່ແບບ PCR. ຫຼັງຈາກການຊໍາລະລ້າງ, ມັນຈໍາເປັນຕ້ອງກໍານົດຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ DNA ເພື່ອສາມາດກໍານົດປະລິມານທີ່ຕ້ອງການສໍາລັບການຕິດຕັ້ງ PCR. ໃນຂະນະທີ່ agarose gel electrophoresis ອາດຈະໃຫ້ບໍລິການໃນການຄາດຄະເນ, ວິທີການນີ້ແມ່ນຢູ່ໄກຈາກຄວາມຖືກຕ້ອງ. UV-Vis spectrophotometry ໄດ້ຖືກສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນເປັນມາດຕະຖານຄໍາສໍາລັບປະລິມານຂອງອາຊິດ nucleic; ວິທີການໂດຍກົງແລະດັ່ງນັ້ນງ່າຍແລະໄວນີ້ວັດແທກການດູດຊຶມຂອງຕົວຢ່າງຢູ່ທີ່ 260 nm, ແລະຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນແມ່ນຄິດໄລ່ດ້ວຍການຊ່ວຍເຫຼືອຂອງປັດໃຈການປ່ຽນແປງ.

ຖ້າຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ DNA ຕໍ່າຫຼາຍ, ແນວໃດກໍ່ຕາມ (< 1 µg/mL dsDNA), ຫຼືຖ້າມັນຖືກປົນເປື້ອນດ້ວຍສານທີ່ດູດຊຶມໃນລະດັບ 260 nm (ເຊັ່ນ: RNA, ທາດໂປຼຕີນ, ເກືອ), ວິທີການນີ້ຈະບັນລຸຂໍ້ຈໍາກັດຂອງມັນ. ໃນກໍລະນີທີ່ມີຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຕໍ່າຫຼາຍ, ການອ່ານຈະກາຍເປັນບໍ່ຖືກຕ້ອງເກີນໄປທີ່ຈະນໍາໃຊ້, ແລະການປົນເປື້ອນຈະນໍາໄປສູ່ການປະເມີນມູນຄ່າຕົວຈິງ (ບາງຄັ້ງກໍ່ໃຫຍ່ຫຼວງ). ໃນກໍລະນີນີ້, ປະລິມານການນໍາໃຊ້ fluorescence ອາດຈະນໍາສະເຫນີທາງເລືອກ. ເຕັກນິກນີ້ແມ່ນອີງໃສ່ການນໍາໃຊ້ສີຍ້ອມ fluorescent ທີ່ຜູກມັດໂດຍສະເພາະກັບ dsDNA ພຽງແຕ່ສະລັບສັບຊ້ອນທີ່ປະກອບດ້ວຍອາຊິດ nucleic ແລະສີຍ້ອມແມ່ນຕື່ນເຕັ້ນໂດຍແສງສະຫວ່າງ, ແລະຕໍ່ມາມັນຈະປ່ອຍແສງສະຫວ່າງຂອງຄວາມຍາວຄື່ນທີ່ສູງຂຶ້ນເລັກນ້ອຍ. ໃນທີ່ນີ້, ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງສັນຍານ fluorescent ແມ່ນອັດຕາສ່ວນກັບຈໍານວນ DNA, ແລະສໍາລັບການກໍານົດຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນມັນຖືກປະເມີນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບເສັ້ນໂຄ້ງມາດຕະຖານ. ຂໍ້ໄດ້ປຽບຂອງວິທີການນີ້ແມ່ນກ່ຽວກັບຄວາມສະເພາະຂອງພັນທະບັດ, ເຊິ່ງບໍ່ລວມເອົາອິດທິພົນພາຍນອກທີ່ນໍາສະເຫນີໂດຍການປົນເປື້ອນ, ເຊັ່ນດຽວກັນກັບຄວາມສາມາດໃນການກວດພົບຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ DNA ຕ່ໍາຫຼາຍ. ຄວາມເຫມາະສົມຂອງວິທີການທັງສອງແມ່ນສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນຂຶ້ນກັບຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງຕົວຢ່າງແລະຄວາມບໍລິສຸດ; ໃນຫຼາຍໆກໍລະນີ, ມັນອາດຈະແນະນໍາໃຫ້ໃຊ້ທັງສອງວິທີການຂະຫນານ.