Och wann an der Theorie eng Molekül vun der Schabloun genuch wier, gi wesentlech méi grouss Quantitéiten un DNA typesch fir e klassesche PCR benotzt, zum Beispill, bis zu 1 µg genomesch Mamendéieren DNA an esou wéineg wéi 1 pg plasmid DNA. Den optimale Betrag hänkt haaptsächlech vun der Unzuel vun de Kopien vun der Zilsequenz of, wéi och vu senger Komplexitéit.
Wann ganz wéineg Schabloun benotzt gëtt, gëtt eng entspriechend Erhéijung vun der Unzuel vun de Verstärkungszyklen gebraucht fir eng genuch Betrag vum Produkt ze kréien. Eng Taq Polymerase, déi fir déi meescht PCR Experimenter benotzt gëtt, huet keng Korrekturfunktioun (3'-5' Exonuklease Aktivitéit); also, Feeler geschéien während amplification kann net korrigéiert ginn. Wat méi héich d'Zuel vun den Zyklen ass, dest méi heefeg ass d'Verstäerkung vum fehlerhafte Produkt. Wann, op der anerer Säit, d'Quantitéit vun der Schabloun ze héich ass, wäert d'Wahrscheinlechkeet datt Primer an aner (net honnert Prozent komplementär) Sequenzen annealéieren, wéi och d'Bildung vu Primer-Dimeren eropgoen, wat zu der Amplifikatioun vun Nebenprodukter. A ville Fäll gëtt DNA aus Zellkulturen oder vu Mikroorganismen isoléiert an duerno als PCR Schabloun benotzt. No der Reinigung ass et néideg d'Konzentratioun vun der DNA ze bestëmmen fir de Volume ze definéieren deen fir de PCR-Setup erfuerderlech ass. Iwwerdeems Agarose Gel Elektrophorese kann déngen fir eng Schätzung ze bidden, ass dës Method wäit net richteg. UV-Vis Spektrofotometrie gouf als Goldstandard fir d'Quantifizéierung vun Nukleinsäuren etabléiert; Dës direkt an dofir einfach a séier Method moosst d'Absorptioun vun der Probe bei 260 nm, an d'Konzentratioun gëtt mat Hëllef vun engem Konversiounsfaktor berechent.
Wann d'DNA Konzentratioun awer ganz niddereg ass (< 1 µg/ml dsDNA), oder wann et mat Substanzen kontaminéiert ass, déi och am 260 nm Beräich absorbéieren (z.B. RNA, Protein, Salzer), wäert dës Method seng Aschränkungen erreechen. Am Fall vu ganz nidderegen Konzentratioune wäerten d'Liesunge geschwënn ze ongenau ginn fir ze benotzen, an d'Kontaminatioune féieren zu (heiansdo enorm) Iwwerschätzung vum eigentleche Wäert. An dësem Fall kann d'Quantifikatioun mat der Fluoreszenz eng Alternativ presentéieren. Dës Technik baséiert op der Notzung vun engem fluoreszenten Faarfstoff, deen speziell un dsDNA bindt, nëmmen de Komplex aus Nukleinsäure a Faarf gëtt vum Liicht opgereegt, an et wäert duerno Liicht vun enger liicht méi héijer Wellelängt emittéieren. Hei ass d'Intensitéit vum fluoreszent Signal proportional zum Betrag vun der DNA, a fir d'Konzentratioun ze bestëmmen gëtt se par rapport zu enger Standardkurve bewäert. D'Virdeeler vun dëser Methode riicht op d'Spezifizitéit vun der Bindung, déi extern Aflëss ausgeschloss, déi duerch Kontaminatioun agefouert ginn, wéi och op déi resultéierend Fäegkeet fir ganz niddereg Konzentratioune vun DNA z'entdecken. D'Suitability vun entweder Method hänkt haaptsächlech op Prouf Konzentratioun a Rengheet; a ville Fäll kann et souguer ubruecht sinn, béid Methoden parallel anzesetzen.
Post Zäit: Nov-30-2022