Теориялык жактан калыптын бир молекуласы жетиштүү болсо да, классикалык ПТР үчүн, мисалы, 1 мкг геномдук сүт эмүүчүлөрдүн ДНКсы жана 1 пг плазмиддик ДНКга чейин азыраак ДНКнын кыйла чоңураак көлөмү колдонулат. Оптималдуу сумма негизинен максаттуу ырааттуулуктун нускаларынын санына, ошондой эле анын татаалдыгына жараша болот.
Эгерде өтө аз шаблон колдонулса, жетиштүү көлөмдөгү продуктуну алуу үчүн күчөтүү циклдеринин санын тиешелүү көбөйтүү керек болот. Көпчүлүк ПТР эксперименттери үчүн колдонулган Taq полимеразасы коррекциялоо функциясына ээ эмес (3′-5′ экзонуклеаза активдүүлүгү); Ошентип, күчөтүү учурунда пайда болгон каталарды оңдоого болбойт. Циклдердин саны канчалык көп болсо, кемчиликтүү продуктунун күчөшү ошончолук көп болот. Эгерде, экинчи жагынан, шаблондун көлөмү өтө жогору болсо, праймерлердин башка (жүз пайыз кошумча эмес) ырааттуулугуна күйүү ыктымалдыгы, ошондой эле праймер димерлеринин пайда болуу ыктымалдыгы жогорулайт, бул кошумча продуктылар. Көпчүлүк учурларда, ДНК клетка культураларынан же микроорганизмдерден бөлүнүп алынат жана андан кийин ПТР үлгүсү катары колдонулат. Тазалоодон кийин, ПТР орнотуу үчүн талап кылынган көлөмдү аныктоо үчүн ДНКнын концентрациясын аныктоо керек. Агароз гел электрофорез баа берүү үчүн кызмат кыла алат, ал эми бул ыкма так эмес. UV-Vis спектрофотометриясы нуклеиндик кислоталардын санын аныктоонун алтын стандарты катары белгиленген; бул түз, ошондуктан жеңил жана тез ыкма үлгүнүн 260 нм абсорбциясын өлчөйт жана концентрация конверсия коэффициентинин жардамы менен эсептелет.
Эгерде ДНК концентрациясы өтө төмөн болсо (< 1 мкг/мл dsDNA) же ал 260 нм диапазондо сиңүүчү заттар (мисалы, РНК, белок, туздар) менен булганса, бул ыкма өзүнүн чектөөлөрүнө жетет. Өтө төмөн концентрациялар болгон учурда, көрсөткүчтөр тез арада колдонуу үчүн өтө так эмес болуп калат жана булгануулар иш жүзүндөгү маанини (кээде өтө чоң) ашыкча баалоого алып келет. Бул учурда, флуоресценцияны колдонуу менен сандык аныктоо альтернатива болушу мүмкүн. Бул ыкма флуоресценттик боёкту колдонууга негизделген, ал атайын dsDNA менен нуклеин кислотасын камтыган комплексти гана байланыштырат жана боёк жарык менен козголот жана ал кийинчерээк бир аз жогору толкун узундуктагы жарыкты чыгарат. Бул жерде флуоресценттик сигналдын интенсивдүүлүгү ДНКнын көлөмүнө пропорционалдуу, ал эми концентрацияны аныктоо үчүн стандарттуу ийри сызыкка карата бааланат. Бул ыкманын артыкчылыктары булгануу менен киргизилген тышкы таасирлерди жокко чыгарган байланыштын өзгөчөлүгүнө, ошондой эле ДНКнын өтө төмөн концентрациясын аныктоого байланыштуу. Ар бир ыкманын ылайыктуулугу негизинен үлгү концентрациясына жана тазалыгына жараша болот; көп учурларда ал тургай, параллелдүү эки ыкмаларды колдонуу максатка ылайыктуу болушу мүмкүн.
Посттун убактысы: Ноябр-30-2022