Her çend di teorîyê de, molekulek şablonê bes be jî, bi gelemperî ji bo PCR-ya klasîk mîqdarên DNA yên pir mezintir têne bikar anîn, mînakî, heya 1 μg ADNya mammalên genomîk û bi qasî 1 pg ADNya plasmîdê. Mîqdara çêtirîn bi piranî bi hejmara kopiyên rêzika armancê, û hem jî bi tevliheviya wê ve girêdayî ye.
Ger şablonek pir hindik were bikar anîn, ji bo bidestxistina hejmarek têr a hilberê dê zêdebûnek têkildar di hejmara çerxên zêdekirinê de hewce bike. Polymerase Taq ku ji bo piraniya ceribandinên PCR tê bikar anîn fonksiyonek rastkirinê (3'-5' çalakiya exonukleazê) nake; Ji ber vê yekê, xeletiyên ku di dema zêdebûnê de çêdibin nekarin werin rast kirin. Her ku jimara dorhêlan zêde bibe, dê zêdekirina hilbera xeletî pirtir be. Ger ji hêla din ve, mîqdara şablonê pir zêde be, îhtîmala ku primerên ku li rêzikên din (ne ji sedî sed pejirandî) vebin, û hem jî çêbûna dimerên pêşîn, dê zêde bibe, ku dê bibe sedema zêdekirina by-berhemên. Di gelek rewşan de, DNA ji çandên şaneyê an ji mîkroorganîzmayan tê veqetandin û dûv re wekî şablonek PCR tê bikar anîn. Piştî paqijkirinê, pêdivî ye ku meriv hûrbûna DNA-yê were destnîşankirin da ku meriv bikaribe qebareya ku ji bo sazkirina PCR-ê hewce dike diyar bike. Digel ku elektroforeziya gel agarose dikare ji bo texmînek peyda bike, ev rêbaz ji rast dûr e. Spectrophotometry UV-Vis ji bo pîvandina asîdên nukleîk wekî standardek zêrîn hate damezrandin; ev rêbaza rasterast û ji ber vê yekê hêsan û bilez vegirtinê ya nimûneyê di 260 nm de dipîve, û berhevdan bi alîkariya faktorek veguheztinê tê hesibandin.
Lêbelê, heke tansiyona DNA pir kêm be (< 1 μg/mL dsDNA), an jî heke bi maddeyên ku di navbeyna 260 nm de jî vedixwe (mînak ARN, proteîn, xwê) vegirtî be, ev rêbaz dê bigihîje sînorên xwe. Di rewşa tansiyonên pir kêm de, xwendin dê di demek nêzîk de pir nerast bibin ku werin bikar anîn, û gemarî dê bibe sedema zêdenirxandina (carinan pir mezin) ya nirxa rastîn. Di vê rewşê de, hejmartina bi karanîna fluorescence dikare alternatîfek peyda bike. Ev teknîk li ser bingeha karanîna rengê fluorescentê ye ku bi taybetî bi dsDNA-yê ve girêdide tenê kompleksa ku ji asîda nukleîk pêk tê û boyax ji ronahiyê heyecan e, û ew ê dûv re ronahiya bi dirêjahiya pêlê hinekî bilindtir derxe. Li vir, tundiya sînyala fluorescentê bi mîqdara ADN-ê re têkildar e, û ji bo destnîşankirina tansiyonê ew li gorî kelek standard tê nirxandin. Feydeyên vê rêbazê li ser taybetmendiya girêdanê ye, ku bandorên derveyî yên ku ji hêla gemarê ve têne derxistin, û her weha li ser şiyana encam a tespîtkirina tansiyonên pir kêm ên DNA-yê vedigire. Lihevhatina her rêbazê bi giranî bi giranî û paqijiya nimûneyê ve girêdayî ye; di gelek rewşan de dibe ku tewra bikêrhatina her du rêbazan jî paralel be.
Dema şandinê: Nov-30-2022