냉동 바이알액체 질소로 채워진 듀어에서 세포주 및 기타 중요한 생물학적 물질을 극저온으로 보관하는 데 일반적으로 사용됩니다.

액체질소에서 세포를 성공적으로 보존하는 데에는 여러 단계가 있습니다. 기본 원리는 느린 동결이지만, 사용되는 정확한 기술은 사용되는 세포 유형과 동결 방지제에 따라 다릅니다. 이렇게 낮은 온도에서 셀을 보관할 때 고려해야 할 몇 가지 안전 고려 사항과 모범 사례가 있습니다.

이 게시물은 극저온병이 액체 질소에 저장되는 방법에 대한 개요를 제공하는 것을 목표로 합니다.

크라이오바이알이란?

크라이오바이알(Cryovial)은 극저온에서 액체 시료를 보관하기 위해 설계된 작은 뚜껑이 있는 바이알입니다. 그들은 동결 보호제에 보존된 세포가 액체 질소와 직접 접촉하지 않도록 하여 세포 골절의 위험을 최소화하는 동시에 액체 질소의 극한 냉각 효과의 이점을 누릴 수 있습니다.

바이알은 일반적으로 다양한 용량과 디자인으로 제공됩니다. 내부 또는 외부 나사산이 있고 바닥이 평평하거나 둥글게 되어 있습니다. 멸균 및 비멸균 형식도 사용할 수 있습니다.

누가 사용하는가사이로바이알액체 질소에 세포를 저장하려면

다양한 NHS 및 민간 실험실과 제대혈 은행, 상피 세포 생물학, 면역학 및 줄기 세포 생물학을 전문으로 하는 연구 기관에서는 냉동 바이알을 사용하여 세포를 냉동 보존합니다.

이러한 방식으로 보존되는 세포에는 B 및 T 세포, CHO 세포, 조혈 줄기 및 전구 세포, 하이브리도마, 장 세포, 대식세포, 중간엽 줄기 및 전구 세포, 단핵구, 골수종, NK 세포 및 다능성 줄기 세포가 포함됩니다.

액체 질소에 극저온 보관 방법 개요

냉동보존은 세포와 기타 생물학적 구조물을 매우 낮은 온도로 냉각하여 보존하는 과정입니다. 세포는 세포 생존력의 손실 없이 수년간 액체 질소에 보관될 수 있습니다. 이는 채택된 절차의 개요입니다.

세포 준비

샘플을 준비하는 정확한 방법은 세포 유형에 따라 다르지만 일반적으로 세포를 수집하고 원심분리하여 세포가 풍부한 펠릿을 개발합니다. 그런 다음 이 펠릿을 동결 보호제 또는 동결 보존 배지와 혼합된 상층액에 재현탁합니다.

냉동 보존 매체

이 배지는 세포 내 및 세포 외 결정의 형성을 억제하여 세포 사멸을 억제함으로써 저온 환경에서 세포를 보존하는 데 사용됩니다. 이들의 역할은 냉동, 보관, 해동 과정에서 세포와 조직에 안전하고 보호적인 환경을 제공하는 것입니다.

신선동결 혈장(FFP), 헤파린 처리 플라스마라이트 용액 또는 무혈청, 동물 성분이 없는 용액과 같은 배지를 디메틸설폭사이드(DMSO) 또는 글리세롤과 같은 동결 보호제와 혼합합니다.

재액화된 샘플 펠릿은 다음과 같은 폴리프로필렌 냉동 바이알에 분취됩니다.Suzhou Ace Biomedical 회사 극저온 보관 바이알.

균열 위험과 내용물 방출 가능성이 증가하므로 냉동 바이알을 과도하게 채우지 않는 것이 중요합니다(1).

제어된 동결 속도

일반적으로 세포의 성공적인 냉동보존을 위해서는 느리게 제어되는 냉동 속도가 사용됩니다.

검체를 극저온 바이알에 분주한 후 젖은 얼음이나 4℃ 냉장고에 넣고 5분 이내에 냉동 과정을 시작합니다. 일반적으로 셀은 분당 -1~-3의 속도로 냉각됩니다(2). 이는 프로그래밍 가능한 냉각기를 사용하거나 -70°C ~ -90°C로 제어되는 속도 냉동고에 있는 절연 상자에 바이알을 배치함으로써 달성됩니다.

액체질소로 옮김

냉동된 극저온 바이알은 -135℃ 미만의 온도가 유지되는 한 무기한 액체 질소 탱크로 옮겨집니다.

이러한 초저온은 액체 또는 증기상 질소에 담그면 얻을 수 있습니다.

액체 또는 증기상?

액상 질소에 저장하는 것은 절대적인 일관성으로 차가운 온도를 유지하는 것으로 알려져 있지만 다음과 같은 이유로 권장되지 않는 경우가 많습니다.

• 잠재적인 위험이 있는 액체 질소의 대량(깊이)이 필요합니다. 이로 인한 화상이나 질식은 실제 위험입니다.
• 아스페르길루스, B형 간염 및 액체 질소 매체를 통한 바이러스 확산과 같은 감염원에 의한 교차 오염 사례가 기록되어 있습니다(2,3)
• 담그는 동안 액체 질소가 유리병으로 누출될 가능성이 있습니다. 저장소에서 꺼내 실온으로 가열하면 질소가 빠르게 팽창합니다. 결과적으로, 액체 질소 저장소에서 제거할 때 유리병이 부서져 파편이 날아오고 내용물에 노출될 위험이 발생할 수 있습니다(1, 4).

이러한 이유로 초저온 저장은 증기상 질소에서 가장 일반적으로 이루어집니다. 시료를 액체 상태로 보관해야 하는 경우 특수한 극저온 튜브를 사용해야 합니다.

증기상의 단점은 수직 온도 구배가 발생하여 -135℃에서 -190℃ 사이의 온도 변동이 발생할 수 있다는 것입니다. 이를 위해서는 액체 질소 수준과 온도 변화를 주의 깊게 모니터링해야 합니다(5).

많은 제조업체에서는 극저온 바이알을 -135℃까지 보관하거나 증기상에서만 사용하는 데 적합하다고 권장합니다.

냉동보존된 세포를 해동하기

해동 절차는 냉동 배양에 스트레스가 많으므로 세포의 최적 생존력, 회복 및 기능을 보장하려면 적절한 취급 및 기술이 필요합니다. 정확한 해동 프로토콜은 특정 세포 유형에 따라 달라집니다. 그러나 다음과 같은 경우 급속 해동이 표준으로 간주됩니다.

• 세포 회복에 미치는 영향 감소
• 냉동 매체에 존재하는 용질에 대한 노출 시간을 줄이는 데 도움이 됩니다.
• 얼음 재결정화로 인한 손상 최소화

샘플을 해동하는 데 일반적으로 수조, 비드 욕조 또는 특수 자동화 기기가 사용됩니다.

가장 흔히 1개의 세포주를 한 번에 1~2분 동안 해동하며, 미리 데워진 성장 배지에서 세척하기 전에 바이알에 약간의 얼음이 남을 때까지 37℃ 수조에서 부드럽게 저어줍니다.

포유류 배아와 같은 일부 세포의 경우 생존을 위해서는 느린 온난화가 필수적입니다.

이제 세포는 세포 배양, 세포 분리 또는 조혈 줄기 세포의 경우 골수 파괴 치료 전에 기증자 줄기 세포의 완전성을 보장하기 위한 생존 가능성 연구를 위한 준비가 되었습니다.

배양 시 플레이팅할 세포 농도를 결정하기 위해 세포 수를 측정하는 데 사용되는 사전 세척된 샘플의 작은 부분 표본을 채취하는 것이 일반적인 관행입니다. 그런 다음 세포 분리 절차의 결과를 평가하고 세포 생존 가능성을 확인할 수 있습니다.

극저온 보관 모범 사례

냉동 바이알에 저장된 샘플의 성공적인 냉동 보존은 적절한 보관 및 기록 유지를 포함한 프로토콜의 많은 요소에 따라 달라집니다.

• 저장 위치 간 셀 분할– 용량이 허용하는 경우 바이알 간에 셀을 분할하여 별도의 위치에 보관하여 장비 고장으로 인한 샘플 손실 위험을 줄입니다.
• 교차오염 방지– 이후 사용 전 일회용 멸균 극저온 바이알 또는 오토클레이브를 선택하세요.
• 세포에 적합한 크기의 바이알을 사용하십시오.– 바이알의 용량은 1~5ml입니다. 균열 위험을 줄이려면 바이알을 너무 많이 채우지 마십시오.
• 내부 또는 외부 스레드 극저온 바이알 선택– 일부 대학에서는 안전 조치를 위해 내부 스레드 바이알을 권장합니다. 또한 충전 중이나 액체 질소에 보관할 때 오염을 방지할 수도 있습니다.
• 누출 방지- 누출과 오염을 방지하기 위해 나사 캡이나 O-링에 성형된 이중 주입 씰을 사용하십시오.
• 2D 바코드 및 라벨 바이알 사용– 추적성을 보장하기 위해 넓은 쓰기 영역이 있는 바이알을 사용하면 각 바이알에 적절한 라벨을 붙일 수 있습니다. 2D 바코드는 저장 관리 및 기록 보관에 도움이 될 수 있습니다. 색상으로 구분된 캡은 쉽게 식별하는 데 유용합니다.
• 적절한 스토리지 유지 관리- 세포가 손실되지 않도록 보관 용기는 온도와 액체질소 수준을 지속적으로 모니터링해야 합니다. 사용자에게 오류를 알리는 경보 장치를 설치해야 합니다.

안전 예방 조치

액체 질소는 현대 연구에서 일반적인 관행이 되었지만 잘못 사용하면 심각한 부상을 입을 위험이 있습니다.

액체질소를 취급할 때 동상, 화상 및 기타 부작용의 위험을 최소화하려면 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용해야 합니다. 입다

• 극저온 장갑
• 실험실 코트
• 목도 덮는 충격 방지 전면 보호대
• 발가락이 막힌 신발
• 방수 플라스틱 앞치마

질식 위험을 최소화하려면 액체 질소 냉장고를 통풍이 잘 되는 곳에 두어야 합니다. 누출된 질소는 기화되어 대기 산소를 대체합니다. 대형 매장에는 저산소 경보 시스템을 갖추어야 합니다.

액체질소를 취급할 때는 2인 1조로 작업하는 것이 이상적이며 정규 근무 시간 외에는 사용을 금지해야 합니다.

귀하의 작업 흐름을 지원하는 냉동보관

Suzhou Ace Biomedical 회사는 다양한 유형의 세포에 대한 냉동 보존 요구 사항을 충족하는 다양한 제품을 제공합니다. 포트폴리오에는 다양한 튜브와 다양한 멸균 냉동바이알이 포함됩니다.

우리의 냉동보관은 다음과 같습니다:

• 실험실 나사 캡 0.5mL 1.5mL 2.0mL Cryovial 극저온 바이알 가스켓이 있는 원추형 바닥 Cryotube

  ● 0.5ml,1.5ml,2.0ml 사양, 스커트 포함 또는 스커트 없음
  ● 원추형 또는 자립형 디자인, 멸균 또는 비멸균 모두 사용 가능
  ● 스크류 캡 튜브는 의료용 폴리프로필렌으로 제작됩니다.
  ● PP Cryotube Vial은 냉동과 해동을 반복할 수 있습니다.
  ●외부 캡 설계로 시료 처리 중 오염 가능성을 줄일 수 있습니다.
  ● 스크류 캡 극저온 튜브 범용 나사산 사용
  ● 튜브는 가장 일반적인 로터에 맞습니다.
  ● 극저온 튜브 O-링 튜브는 표준 1인치 및 2인치, 48웰, 81웰, 96웰 및 100웰 냉동고 상자에 적합합니다.
  ● 121°C까지 오토클레이브 가능, -86°C까지 냉동 가능

  부품 번호	재료	용량	캡색상	PCS/가방	가방/케이스
  ACT05-BL-N	PP	0.5ML	검정, 노랑, 파랑, 빨강, 보라색, 흰색	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1.5ML	검정, 노랑, 파랑, 빨강, 보라색, 흰색	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1.5ML	검정, 노랑, 파랑, 빨강, 보라색, 흰색	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2.0ML	검정, 노랑, 파랑, 빨강, 보라색, 흰색	500	10