이론적으로는 하나의 주형 분자이면 충분하지만, 일반적으로 고전적인 PCR에는 훨씬 더 많은 양의 DNA(예: 최대 1μg의 게놈 포유류 DNA 및 1pg의 적은 플라스미드 DNA)가 사용됩니다. 최적의 양은 대상 시퀀스의 복사본 수와 복잡성에 따라 크게 달라집니다.
매우 적은 양의 템플릿을 사용하는 경우 충분한 양의 제품을 얻으려면 증폭 주기 수를 늘려야 합니다. 대부분의 PCR 실험에 사용되는 Taq 중합효소에는 보정 기능(3'-5' 엑소뉴클레아제 활성)이 없습니다. 따라서 증폭 중에 발생하는 오류는 수정할 수 없습니다. 사이클 수가 많을수록 결함이 있는 제품이 증폭되는 경우가 더 많습니다. 반면, 주형의 양이 너무 많으면 프라이머가 다른(100% 상보적이지 않은) 서열과 어닐링할 확률이 높아지고 프라이머 이량체가 형성될 확률이 높아져 다음과 같은 증폭이 발생합니다. 부산물. 많은 경우 DNA는 세포 배양물이나 미생물로부터 분리된 후 PCR 주형으로 사용됩니다. 정제 후에는 PCR 설정에 필요한 부피를 정의할 수 있도록 DNA의 농도를 결정해야 합니다. 아가로스 겔 전기영동은 추정치를 제공하는 데 도움이 될 수 있지만 이 방법은 정확하지 않습니다. UV-Vis 분광광도법은 핵산 정량화를 위한 최적의 표준으로 확립되었습니다. 이 직접적이고 따라서 쉽고 빠른 방법은 260nm에서 시료의 흡광도를 측정하고 변환 계수를 사용하여 농도를 계산합니다.
그러나 DNA 농도가 매우 낮거나(< 1 µg/mL dsDNA) 260 nm 범위에서도 흡수되는 물질(예: RNA, 단백질, 염)로 오염된 경우 이 방법은 한계에 도달합니다. 농도가 매우 낮은 경우 판독값은 곧 사용하기에 너무 부정확해지며 오염으로 인해 실제 값이 (때로는 엄청나게) 과대평가될 수 있습니다. 이 경우 형광을 이용한 정량화가 대안을 제시할 수 있습니다. 이 기술은 핵산과 염료로 구성된 복합체만 dsDNA에 특이적으로 결합하는 형광 염료의 사용을 기반으로 하며, 염료는 빛에 의해 여기되어 약간 더 높은 파장의 빛을 방출합니다. 여기서 형광 신호의 강도는 DNA의 양에 비례하며, 농도를 결정하기 위해서는 표준 곡선과 관련하여 평가됩니다. 이 방법의 장점은 오염으로 인한 외부 영향을 배제하는 결합의 특이성과 매우 낮은 농도의 DNA를 검출할 수 있는 능력에 있습니다. 두 방법의 적합성은 주로 시료 농도와 순도에 따라 달라집니다. 많은 경우 두 가지 방법을 동시에 적용하는 것이 바람직할 수도 있습니다.
게시 시간: 2022년 11월 30일