ನನ್ನ ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗೆ ನಾವು ಎಷ್ಟು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಬೇಕು?

ಸಿದ್ಧಾಂತದಲ್ಲಿದ್ದರೂ, ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನ ಒಂದು ಅಣುವು ಸಾಕಾಗುತ್ತದೆ, ಕ್ಲಾಸಿಕ್ ಪಿಸಿಆರ್‌ಗಾಗಿ ಗಣನೀಯವಾಗಿ ದೊಡ್ಡ ಪ್ರಮಾಣದ ಡಿಎನ್‌ಎ ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಉದಾಹರಣೆಗೆ, 1 µg ಜೀನೋಮಿಕ್ ಸಸ್ತನಿ ಡಿಎನ್‌ಎ ವರೆಗೆ ಮತ್ತು 1 ಪಿಜಿ ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ ಡಿಎನ್‌ಎ ಕಡಿಮೆ. ಸೂಕ್ತವಾದ ಮೊತ್ತವು ಹೆಚ್ಚಾಗಿ ಗುರಿ ಅನುಕ್ರಮದ ಪ್ರತಿಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಅವಲಂಬಿಸಿರುತ್ತದೆ, ಜೊತೆಗೆ ಅದರ ಸಂಕೀರ್ಣತೆಯ ಮೇಲೆ ಅವಲಂಬಿತವಾಗಿರುತ್ತದೆ.

ಕಡಿಮೆ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿದರೆ, ಸಾಕಷ್ಟು ಪ್ರಮಾಣದ ಉತ್ಪನ್ನವನ್ನು ಪಡೆಯಲು ವರ್ಧನೆ ಚಕ್ರಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯಲ್ಲಿ ಅನುಗುಣವಾದ ಹೆಚ್ಚಳ ಅಗತ್ಯವಿರುತ್ತದೆ. ಹೆಚ್ಚಿನ ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಗೆ ಬಳಸಲಾಗುವ TAQ ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ತಿದ್ದುಪಡಿ ಕಾರ್ಯವನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿಲ್ಲ (3′-5 ′ EXONUCLEASE ಚಟುವಟಿಕೆ); ಹೀಗಾಗಿ, ವರ್ಧನೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಸಂಭವಿಸುವ ದೋಷಗಳನ್ನು ಸರಿಪಡಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಿಲ್ಲ. ಹೆಚ್ಚಿನ ಚಕ್ರಗಳ ಸಂಖ್ಯೆ, ದೋಷಪೂರಿತ ಉತ್ಪನ್ನದ ವರ್ಧನೆಯು ಹೆಚ್ಚು ಪ್ರಚಲಿತದಲ್ಲಿರುತ್ತದೆ. ಮತ್ತೊಂದೆಡೆ, ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನ ಪ್ರಮಾಣವು ತುಂಬಾ ಹೆಚ್ಚಿದ್ದರೆ, ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ಸಂಭವನೀಯತೆ ಇತರ (ನೂರು ಪ್ರತಿಶತ ಪೂರಕವಲ್ಲ) ಅನುಕ್ರಮಗಳಿಗೆ ಅನೆಲಿಂಗ್ ಆಗುತ್ತದೆ, ಜೊತೆಗೆ ಪ್ರೈಮರ್ ಡೈಮರ್‌ಗಳ ರಚನೆಯು ಹೆಚ್ಚಾಗುತ್ತದೆ, ಇದು ವರ್ಧನೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ ಉಪ-ಉತ್ಪನ್ನಗಳು. ಅನೇಕ ಸಂದರ್ಭಗಳಲ್ಲಿ, ಡಿಎನ್‌ಎ ಅನ್ನು ಕೋಶ ಸಂಸ್ಕೃತಿಗಳಿಂದ ಅಥವಾ ಸೂಕ್ಷ್ಮಜೀವಿಗಳಿಂದ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ತರುವಾಯ ಪಿಸಿಆರ್ ಟೆಂಪ್ಲೆಟ್ ಆಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಶುದ್ಧೀಕರಣದ ನಂತರ, ಪಿಸಿಆರ್ ಸೆಟಪ್‌ಗೆ ಅಗತ್ಯವಾದ ಪರಿಮಾಣವನ್ನು ವ್ಯಾಖ್ಯಾನಿಸಲು ಡಿಎನ್‌ಎ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸುವುದು ಅವಶ್ಯಕ. ಅಗರೋಸ್ ಜೆಲ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್ ಅಂದಾಜು ನೀಡಲು ಸಹಾಯ ಮಾಡುತ್ತದೆ, ಆದರೆ ಈ ವಿಧಾನವು ನಿಖರತೆಯಿಂದ ದೂರವಿದೆ. ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲಗಳ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣದ ಚಿನ್ನದ ಮಾನದಂಡವಾಗಿ ಯುವಿ-ವಿಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಫೋಟೋಮೆಟ್ರಿ ಸ್ಥಾಪಿಸಲಾಗಿದೆ; ಈ ನೇರ ಮತ್ತು ಆದ್ದರಿಂದ ಸುಲಭ ಮತ್ತು ತ್ವರಿತ ವಿಧಾನವು 260 nm ನಲ್ಲಿ ಮಾದರಿಯ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯನ್ನು ಅಳೆಯುತ್ತದೆ, ಮತ್ತು ಪರಿವರ್ತನೆ ಅಂಶದ ಸಹಾಯದಿಂದ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗುತ್ತದೆ.

ಡಿಎನ್‌ಎ ಸಾಂದ್ರತೆಯು ತುಂಬಾ ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದ್ದರೆ, (<1 µg/mL DSDNA), ಅಥವಾ ಅದು 260 nm ವ್ಯಾಪ್ತಿಯಲ್ಲಿ (ಉದಾ. RNA, ಪ್ರೋಟೀನ್, ಲವಣಗಳು) ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವ ವಸ್ತುಗಳಿಂದ ಕಲುಷಿತವಾಗಿದ್ದರೆ, ಈ ವಿಧಾನವು ಅದರ ಮಿತಿಗಳನ್ನು ತಲುಪುತ್ತದೆ. ಕಡಿಮೆ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಸಂದರ್ಭದಲ್ಲಿ, ವಾಚನಗೋಷ್ಠಿಗಳು ಶೀಘ್ರದಲ್ಲೇ ಬಳಕೆಗೆ ತಕ್ಕಂತೆ ನಿಖರವಾಗಿಲ್ಲ, ಮತ್ತು ಮಾಲಿನ್ಯಗಳು ನಿಜವಾದ ಮೌಲ್ಯವನ್ನು (ಕೆಲವೊಮ್ಮೆ ಅಗಾಧ) ಅತಿಯಾಗಿ ಅಂದಾಜು ಮಾಡಲು ಕಾರಣವಾಗುತ್ತವೆ. ಈ ಸಂದರ್ಭದಲ್ಲಿ, ಪ್ರತಿದೀಪಕತೆಯನ್ನು ಬಳಸುವ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣವು ಪರ್ಯಾಯವನ್ನು ಪ್ರಸ್ತುತಪಡಿಸಬಹುದು. ಈ ತಂತ್ರವು ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಬಣ್ಣವನ್ನು ಬಳಸುವುದನ್ನು ಆಧರಿಸಿದೆ, ಅದು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ಡಿಎಸ್‌ಡಿಎನ್‌ಎಗೆ ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲ ಮತ್ತು ಬಣ್ಣವನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಸಂಕೀರ್ಣವು ಬೆಳಕಿನಿಂದ ಉತ್ಸುಕವಾಗಿದೆ, ಮತ್ತು ಇದು ತರುವಾಯ ಸ್ವಲ್ಪ ಹೆಚ್ಚಿನ ತರಂಗಾಂತರದ ಬೆಳಕನ್ನು ಹೊರಸೂಸುತ್ತದೆ. ಇಲ್ಲಿ, ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಸಂಕೇತದ ತೀವ್ರತೆಯು ಡಿಎನ್‌ಎ ಪ್ರಮಾಣಕ್ಕೆ ಅನುಪಾತದಲ್ಲಿರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಕ್ರರೇಖೆಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದಂತೆ ಅದನ್ನು ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ಈ ವಿಧಾನದ ಅನುಕೂಲಗಳು ಬಂಧದ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯ ಮೇಲೆ ವಿಶ್ರಾಂತಿ ಪಡೆಯುತ್ತವೆ, ಇದು ಮಾಲಿನ್ಯದಿಂದ ಪರಿಚಯಿಸಲಾದ ಬಾಹ್ಯ ಪ್ರಭಾವಗಳನ್ನು ಮತ್ತು ಡಿಎನ್‌ಎಯ ಕಡಿಮೆ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚುವ ಸಾಮರ್ಥ್ಯದ ಮೇಲೆ ಹೊರಗಿದೆ. ಎರಡೂ ವಿಧಾನದ ಸೂಕ್ತತೆಯು ಮುಖ್ಯವಾಗಿ ಮಾದರಿ ಸಾಂದ್ರತೆ ಮತ್ತು ಶುದ್ಧತೆಯನ್ನು ಅವಲಂಬಿಸಿರುತ್ತದೆ; ಅನೇಕ ಸಂದರ್ಭಗಳಲ್ಲಿ ಎರಡೂ ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಸಮಾನಾಂತರವಾಗಿ ಅನ್ವಯಿಸಲು ಸಹ ಸಲಹೆ ನೀಡಬಹುದು.