ನನ್ನ PCR ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗೆ ನಾವು ಎಷ್ಟು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಬೇಕು?

ಸೈದ್ಧಾಂತಿಕವಾಗಿ, ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನ ಒಂದು ಅಣುವು ಸಾಕಾಗುತ್ತದೆಯಾದರೂ, ಗಣನೀಯವಾಗಿ ದೊಡ್ಡ ಪ್ರಮಾಣದ DNA ಅನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಕ್ಲಾಸಿಕ್ PCR ಗೆ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಉದಾಹರಣೆಗೆ, 1 µg ವರೆಗೆ ಜೀನೋಮಿಕ್ ಸಸ್ತನಿ DNA ಮತ್ತು 1 pg ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ DNA. ಸೂಕ್ತ ಮೊತ್ತವು ಗುರಿಯ ಅನುಕ್ರಮದ ಪ್ರತಿಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಾಗಿ ಅವಲಂಬಿಸಿರುತ್ತದೆ, ಜೊತೆಗೆ ಅದರ ಸಂಕೀರ್ಣತೆಯ ಮೇಲೆ ಅವಲಂಬಿತವಾಗಿರುತ್ತದೆ.

ಕಡಿಮೆ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿದರೆ, ಸಾಕಷ್ಟು ಪ್ರಮಾಣದ ಉತ್ಪನ್ನವನ್ನು ಪಡೆಯಲು ವರ್ಧನೆಯ ಚಕ್ರಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯಲ್ಲಿ ಅನುಗುಣವಾದ ಹೆಚ್ಚಳದ ಅಗತ್ಯವಿದೆ. ಹೆಚ್ಚಿನ PCR ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಗೆ ಬಳಸಲಾಗುವ Taq ಪಾಲಿಮರೇಸ್ ತಿದ್ದುಪಡಿ ಕಾರ್ಯವನ್ನು ಹೊಂದಿಲ್ಲ (3′-5′ exonuclease ಚಟುವಟಿಕೆ); ಹೀಗಾಗಿ, ವರ್ಧನೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಸಂಭವಿಸುವ ದೋಷಗಳನ್ನು ಸರಿಪಡಿಸಲಾಗುವುದಿಲ್ಲ. ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಂಖ್ಯೆಯ ಚಕ್ರಗಳು, ದೋಷಯುಕ್ತ ಉತ್ಪನ್ನದ ವರ್ಧನೆಯು ಹೆಚ್ಚು ಪ್ರಚಲಿತವಾಗಿರುತ್ತದೆ. ಮತ್ತೊಂದೆಡೆ, ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನ ಪ್ರಮಾಣವು ತುಂಬಾ ಹೆಚ್ಚಿದ್ದರೆ, ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ಇತರ (ನೂರು ಪ್ರತಿಶತ ಪೂರಕವಲ್ಲ) ಅನುಕ್ರಮಗಳಿಗೆ ಅನೆಲಿಂಗ್ ಮಾಡುವ ಸಂಭವನೀಯತೆ, ಜೊತೆಗೆ ಪ್ರೈಮರ್ ಡೈಮರ್‌ಗಳ ರಚನೆಯು ಹೆಚ್ಚಾಗುತ್ತದೆ, ಇದು ವರ್ಧನೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ ಉಪ-ಉತ್ಪನ್ನಗಳು. ಅನೇಕ ಸಂದರ್ಭಗಳಲ್ಲಿ, ಡಿಎನ್‌ಎ ಜೀವಕೋಶದ ಸಂಸ್ಕೃತಿಗಳಿಂದ ಅಥವಾ ಸೂಕ್ಷ್ಮಜೀವಿಗಳಿಂದ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ ಮತ್ತು ನಂತರ ಪಿಸಿಆರ್ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಆಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಶುದ್ಧೀಕರಣದ ನಂತರ, ಪಿಸಿಆರ್ ಸೆಟಪ್‌ಗೆ ಅಗತ್ಯವಿರುವ ಪರಿಮಾಣವನ್ನು ವ್ಯಾಖ್ಯಾನಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾಗುವಂತೆ ಡಿಎನ್‌ಎ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸುವುದು ಅವಶ್ಯಕ. ಅಗರೋಸ್ ಜೆಲ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್ ಅಂದಾಜು ಮಾಡಲು ಸಹಾಯ ಮಾಡುತ್ತದೆ, ಈ ವಿಧಾನವು ನಿಖರತೆಯಿಂದ ದೂರವಿದೆ. ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲಗಳ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣಕ್ಕೆ UV-Vis ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಫೋಟೋಮೆಟ್ರಿಯನ್ನು ಚಿನ್ನದ ಮಾನದಂಡವಾಗಿ ಸ್ಥಾಪಿಸಲಾಗಿದೆ; ಈ ನೇರ ಮತ್ತು ಆದ್ದರಿಂದ ಸುಲಭ ಮತ್ತು ತ್ವರಿತ ವಿಧಾನವು ಮಾದರಿಯ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯನ್ನು 260 nm ನಲ್ಲಿ ಅಳೆಯುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪರಿವರ್ತನೆ ಅಂಶದ ಸಹಾಯದಿಂದ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗುತ್ತದೆ.

DNA ಸಾಂದ್ರತೆಯು ತುಂಬಾ ಕಡಿಮೆಯಿದ್ದರೆ, ಆದಾಗ್ಯೂ (< 1 µg/mL dsDNA), ಅಥವಾ ಇದು 260 nm ವ್ಯಾಪ್ತಿಯಲ್ಲಿ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವ ವಸ್ತುಗಳಿಂದ ಕಲುಷಿತವಾಗಿದ್ದರೆ (ಉದಾ RNA, ಪ್ರೋಟೀನ್, ಲವಣಗಳು), ಈ ವಿಧಾನವು ಅದರ ಮಿತಿಗಳನ್ನು ತಲುಪುತ್ತದೆ. ಅತ್ಯಂತ ಕಡಿಮೆ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಸಂದರ್ಭದಲ್ಲಿ, ವಾಚನಗೋಷ್ಠಿಗಳು ಶೀಘ್ರದಲ್ಲೇ ಬಳಕೆಗೆ ತುಂಬಾ ನಿಖರವಾಗಿಲ್ಲ, ಮತ್ತು ಮಾಲಿನ್ಯಗಳು ನಿಜವಾದ ಮೌಲ್ಯದ (ಕೆಲವೊಮ್ಮೆ ಅಗಾಧವಾದ) ಅತಿಯಾಗಿ ಅಂದಾಜು ಮಾಡಲು ಕಾರಣವಾಗುತ್ತವೆ. ಈ ಸಂದರ್ಭದಲ್ಲಿ, ಪ್ರತಿದೀಪಕವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣವು ಪರ್ಯಾಯವನ್ನು ಪ್ರಸ್ತುತಪಡಿಸಬಹುದು. ಈ ತಂತ್ರವು ಪ್ರತಿದೀಪಕ ವರ್ಣದ ಬಳಕೆಯನ್ನು ಆಧರಿಸಿದೆ, ಇದು ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲವನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಸಂಕೀರ್ಣವನ್ನು ಮಾತ್ರ ಡಿಎಸ್‌ಡಿಎನ್‌ಎಗೆ ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಬಣ್ಣವು ಬೆಳಕಿನಿಂದ ಉತ್ಸುಕವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಅದು ತರುವಾಯ ಸ್ವಲ್ಪ ಹೆಚ್ಚಿನ ತರಂಗಾಂತರದ ಬೆಳಕನ್ನು ಹೊರಸೂಸುತ್ತದೆ. ಇಲ್ಲಿ, ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಸಂಕೇತದ ತೀವ್ರತೆಯು ಡಿಎನ್‌ಎ ಪ್ರಮಾಣಕ್ಕೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು ಅದನ್ನು ಪ್ರಮಾಣಿತ ಕರ್ವ್‌ಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದಂತೆ ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ. ಈ ವಿಧಾನದ ಪ್ರಯೋಜನಗಳು ಬಂಧದ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯ ಮೇಲೆ ನಿಂತಿದೆ, ಇದು ಮಾಲಿನ್ಯದಿಂದ ಪರಿಚಯಿಸಲಾದ ಬಾಹ್ಯ ಪ್ರಭಾವಗಳನ್ನು ಹೊರತುಪಡಿಸುತ್ತದೆ, ಜೊತೆಗೆ DNA ಯ ಅತ್ಯಂತ ಕಡಿಮೆ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚುವ ಸಾಮರ್ಥ್ಯದ ಮೇಲೆ. ಎರಡೂ ವಿಧಾನಗಳ ಸೂಕ್ತತೆಯು ಮುಖ್ಯವಾಗಿ ಮಾದರಿ ಸಾಂದ್ರತೆ ಮತ್ತು ಶುದ್ಧತೆಯ ಮೇಲೆ ಅವಲಂಬಿತವಾಗಿರುತ್ತದೆ; ಅನೇಕ ಸಂದರ್ಭಗಳಲ್ಲಿ ಸಮಾನಾಂತರವಾಗಿ ಎರಡೂ ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಅನ್ವಯಿಸಲು ಸಲಹೆ ನೀಡಬಹುದು.